前言：

腫瘤壞死因子(TNFα)是一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞炎癥因子，它可以通過許多細(xì)胞通路來調(diào)控各種細(xì)胞事件。此因子是在造血細(xì)胞中引起凋亡而被人們熟知的，如U937，通過激活細(xì)胞內(nèi)半胱天冬酶的級(jí)聯(lián)過程。另一方面，粒巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是 造血生長因子成員之一，可促進(jìn)增殖和/或分化。然而，有報(bào)道稱U937細(xì)胞會(huì)應(yīng)答 GM-CSF而發(fā)生生長抑制和凋亡。因?yàn)門NFα和GM-CSF都會(huì)在U937細(xì)胞中引起 凋亡，但這兩種細(xì)胞活素之間有著不同的時(shí)間進(jìn)程。當(dāng)兩者結(jié)合起來，兩種細(xì)胞活素的高度協(xié)同作用便會(huì)被觀察到。

EarlyTox™細(xì)胞活力試劑盒是評(píng)價(jià)細(xì)胞生 長條件的一類試劑之一，包括細(xì)胞活性和各種凋亡事件。這些試劑設(shè)計(jì)為均相免洗實(shí)驗(yàn)并針對(duì)熒光微孔讀板機(jī)做了優(yōu)化。這里,我們使用三種不同的試劑盒, Live/Dead測(cè)定、Caspase-3/7 R110測(cè)定和Caspase-3/7 NucView 488測(cè)定來檢測(cè)TNFα 和GM-CSF處理U937細(xì)胞的效果(圖 1)

• EarlyTox™ Live/Dead檢測(cè)試劑盒包含兩種針對(duì)哺乳動(dòng)物活細(xì)胞或死細(xì)胞的標(biāo)記物。Calcein AM是一種廣泛用于活細(xì) 胞的標(biāo)記物，而溴化乙錠二聚體-III (EthD-III)通過受損的細(xì)胞膜進(jìn)入死細(xì)胞與DNA結(jié)合以產(chǎn)生明亮的紅色熒光。

• EarlyTox™ Caspase-3/7 R110檢測(cè)試劑盒提供一步、均相測(cè)定，只需細(xì)胞裂解 來對(duì)凋亡過程進(jìn)行終點(diǎn)法分析。

• EarlyTox™ Caspase-3/7 NucView 488 檢測(cè)試劑盒能夠通過利用NucView 488 Caspase-3底物在未受損細(xì)胞群中檢測(cè) 凋亡細(xì)胞。這種試劑對(duì)細(xì)胞無毒并且可 用于凋亡的動(dòng)態(tài)學(xué)研究。

在這一基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，熒光信號(hào)通過 SpectraMax® i3x微孔讀板機(jī)上底讀孔域掃 描功能進(jìn)行檢測(cè)，可獲得孔底12個(gè)位置的 平均信號(hào)以避免因?yàn)闈撛诘募?xì)胞生長不均 所造成的孔與孔之間的差異。

材料：

• U937細(xì)胞(ATCC Cat.# CRL-1593.2)

• 細(xì)胞因子：

• 人類TNFα (Peprotech Cat# 300-01)

• 人類GM-CSF (Peprotech Cat# 300-03)

• EarlyTox細(xì)胞活力試劑盒(Molecular Devices, LLC)：

• EarlyTox Live/Dead檢測(cè)試劑盒(Cat.# R8340)

• EarlyTox Caspase-3/7 R110檢測(cè)試劑盒(Cat.# R8346)

• EarlyTox Caspase-3/7 NucView 488檢測(cè)試劑盒(Cat.# R8348)

• PBS•96-孔，平底，底透，黑色TC-處理的微孔板(Corning cat. #3904)

• SpectraMax i3x多功能微孔讀板機(jī)和 SpectraMax® MiniMax 300成像細(xì)胞計(jì)數(shù)儀

方法：

細(xì)胞培養(yǎng)和處理

U937細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI1640培養(yǎng)基中，添加10%FBS和青霉素/鏈霉素。

實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，細(xì)胞以100,000細(xì)胞/80 µL/孔接種。每孔加入20 µL的5X濃度細(xì)胞因子，其終濃度為1X且體積為100 µL。在37C、5%CO2下孵育處理24或48小時(shí)

細(xì)胞活力和凋亡測(cè)定

處理之后，準(zhǔn)備好的試劑按照以下描述添 加于每孔中。

活/死測(cè)定：2X的calcein AM/EthD-III 工作液由calcein AM和EthD-III儲(chǔ)存液加入到PBS中配成濃度6 µM制成。100 µL的2X工作液添加于每個(gè)檢測(cè)孔中，終體積為 200 µL且每種染料的終濃度為3 µM�？装� 在室溫下孵育1小時(shí),避光。使用如表1中的設(shè)置在SpectraMax i3x讀板機(jī)上檢測(cè)熒光。

Caspase-3/7 R110測(cè)定:底物測(cè)定緩沖液 由酶底物(AC-DEVD)2-R110 (2 mM)加入細(xì)胞裂解/測(cè)定緩沖液中并以50 µL對(duì)1 mL的 比例混合而成。100 µL底物測(cè)定緩沖液加 入到每個(gè)孔中，形成每孔終體積為200 µL 和終濃度為50 µM體系。樣品接下來在室溫下避光孵育1小時(shí)。使用表1中的設(shè)置在 SpectraMax i3x讀板機(jī)上檢測(cè)熒光。

Caspase-3/7 NucView 488測(cè)定：10µM2X的NucView 488底物工作液混合于PBS中。100µL底物工作液加入含有100 µL細(xì) 胞和培養(yǎng)基的孔中形成終濃度為5µM。細(xì) 胞在室溫下避光孵育1小時(shí)。使用 SpectraMax MiniMax細(xì)胞計(jì)數(shù)儀在 541nm綠色熒光通道下進(jìn)行圖像采集，或者在SpectraMax i3x讀板機(jī)上檢測(cè)。請(qǐng)見 表1讀板機(jī)設(shè)置。

結(jié)果

結(jié)果顯示U937細(xì)胞在用TNFα處理時(shí)會(huì)以劑量和時(shí)間依賴的方式經(jīng)歷凋亡過程。 GM-CSF對(duì)U937細(xì)胞處理達(dá)48小時(shí)卻無任 何效果。然而，可以觀察到當(dāng)細(xì)胞與TNFα和GM-CSF混合物一起孵育時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的協(xié)同作用.曾經(jīng)報(bào)道過單獨(dú)的GM-CSF 相對(duì)于TNFα需要更長時(shí)間(72小時(shí)后)才能 通過caspase 3類通路誘導(dǎo)U937細(xì)胞的凋亡，而這兩種細(xì)胞因子的協(xié)同作用卻可以 在24小時(shí)后觀察到。在我們的研究中，這一協(xié)同性直到48小時(shí)后才變得明顯。請(qǐng)見圖2-5。

總結(jié)

通過使用三種不同試劑來檢測(cè)細(xì)胞凋亡的不同數(shù)據(jù)，我們闡明了即混即讀式的實(shí)驗(yàn)?zāi)０蹇珊?jiǎn)化懸浮細(xì)胞的測(cè)定過程。 SpectraMax i3x讀板機(jī)的孔域掃描功能降低了孔與孔之間的差異，校正了整孔細(xì)胞生長和分布不均一的問題。細(xì)胞活力檢測(cè) 試劑家族提供給研究者們多種多樣的檢測(cè) 凋亡和/或細(xì)胞死亡等細(xì)胞事件的有力工 具。