大鼠熱休克蛋白27(HSP-27)ELISA試劑盒操作說明
大鼠熱休克蛋白27(HSP-27)ELISA試劑盒操作說明
本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、細胞上清及相關(guān)液體樣本中大鼠熱休克蛋白27(HSP-27)的含量。
有效期：6個月
保存條件：2-8℃
大鼠熱休克蛋白27(HSP-27)ELISA試劑盒實驗原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被大鼠熱休克蛋白27(HSP-27)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠熱休克蛋白27(HSP-27)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。
大鼠熱休克蛋白27(HSP-27)ELISA試劑盒樣本處理及要求
1. 血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。
3. 細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復凍融。
注：標本溶血會影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
需要而未提供的試劑和器材
- 酶標儀（450nm）
- 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
- 37℃恒溫箱
- 蒸餾水或去離子水
注意事項
- 嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
- 洗板不正確可以導致不準確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
- 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。
- 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍的底物液不能使用。
- 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結(jié)果。
- 在儲存和溫育時避免強光直接照射。
- 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
- 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
- 不能使用過期產(chǎn)品。
- 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
試劑準備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
- 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
- 設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
- 樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
- 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
- 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
- 每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
- 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
實驗結(jié)果計算
以所測標準品的OD值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，在坐標紙上或用相關(guān)軟件繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。
試劑盒性能
- 檢測范圍：3.75 ng/mL – 120 ng/mL。
- 靈敏度：最低檢測濃度小于0.1 ng/mL。
- 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
- 重復性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。
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