張偉†, 顧培明†, 江崢*, 明紅, 陳偉

賽默飛世爾科技(中國)有限公司, 上海 201206

† 同等貢獻(xiàn)

* 聯(lián)系人, E-mail: zheng。jiang@thermofisher。com

 

關(guān)鍵詞 蛋白質(zhì)組學(xué) 快速鑒定 深度覆蓋 靜電場(chǎng)軌道阱 Q-OT-qIT質(zhì)譜

 

蛋白質(zhì)組深度覆蓋分析(in-depth proteome)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的發(fā)展趨勢(shì), 通過大規(guī)模鑒定和挖掘極低豐度的蛋白, 為信號(hào)通路、分子靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物的研究提供重要信息。然而, 由于全蛋白樣本的復(fù)雜性, 蛋白質(zhì)組深度鑒定對(duì)色譜分離要求很高, 通常需要進(jìn)行二維分離(強(qiáng)陰離子交換、高pH反相等), 或使用一維長(zhǎng)梯度分離, 以降低高豐度蛋白的干擾[1,2]。但這樣消耗了大量時(shí)間, 重現(xiàn)性也不佳, 成為蛋白質(zhì)組深度覆蓋研究的瓶頸。

 

靜電場(chǎng)軌道阱(orbitrap)質(zhì)量分析器具有超高分辨率、超高靈敏度等特點(diǎn), 有效推動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展[3,4]。新型Q-OT-qIT(Orbitrap Fusion)質(zhì)譜系統(tǒng)首 次將四極桿(quadrupole, Q)、靜電場(chǎng)軌道阱(orbitrap, OT)和線性離子阱(linear quadrupole ion trap, qIT)3種質(zhì)量分析器集為一體, 利用動(dòng)態(tài)掃描管理技術(shù), 實(shí)現(xiàn)了3種質(zhì)量分析器同時(shí)工作并相互協(xié)作, 一級(jí)、二級(jí)掃描同時(shí)進(jìn)行, 使分析效率達(dá)到最大化[5]。Hebert等人[6]利用Q-OT-qIT質(zhì)譜, 5次重復(fù)實(shí)驗(yàn), 在70min有效梯度下鑒定到約4000個(gè)酵母蛋白, 同樣的結(jié)果, 目前的文獻(xiàn)報(bào)道至少需要4h, 分析效率(單位時(shí)間蛋白鑒定數(shù)量)提高了4倍以上[7,8]�；�于此,Hebert等人[6]首次提出“一小時(shí)酵母蛋白質(zhì)組”的概念, 即1h左右的短梯度實(shí)現(xiàn)酵母蛋白質(zhì)組深度覆蓋。蛋白質(zhì)組學(xué)已進(jìn)入新的時(shí)代。

 

本文使用Q-OT-qIT質(zhì)譜系統(tǒng)對(duì)HeLa和酵母細(xì)胞全蛋白進(jìn)行短梯度快速鑒定, 并對(duì)基于Q-OT-qIT質(zhì)譜的“一小時(shí)蛋白質(zhì)組”深入考察與優(yōu)化。結(jié)果顯示, 單次實(shí)驗(yàn)、50min有效梯度, 分別從1 μg和50 ng HeLa中鑒定到20860和14100條肽段, 對(duì)應(yīng)3865和2877個(gè)非冗余蛋白, 分析效率相比目前的報(bào)道提高了至少2~3倍[9]。本文還對(duì)比和優(yōu)化了多種掃描組合和參數(shù)設(shè)置, 為各類實(shí)驗(yàn)提供了最合適的采集模式。

 

1.1 樣品前處理

分別取適量HeLa和酵母細(xì)胞沉淀, 加入含7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)和50 mmol/L二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol,DTT)的蛋白提取液(使用前加入蛋白酶抑制劑), 在超聲細(xì)胞破碎儀中超聲3×5s. 冰上放置20min后, 于4℃離心30min(15000×g)并取上清, Bradford法測(cè)定總蛋白濃度.

 

向蛋白提取液中加入DTT, 使終濃度為10 mmol/L, 于56℃振蕩30min. 再加入碘乙酰胺(iodoacetamide, IAM), 使終濃度為50 mmol/L, 于室溫避光振蕩40min. 反應(yīng)后, 加入6倍體積的預(yù)冷丙酮, 20℃放置3h, 再于4℃離心30min (15000×g)棄上清. 按10 μg/μL的濃度將沉淀重溶于50 mmol/LNH4HCO3緩沖溶液, 并加入足量胰蛋白酶(trypsin), 37℃酶解過夜. 酶解后, 將全蛋白酶解液稀釋至終濃度為0.5 μg/μL.

 

1.2 納流液相色譜方法

色譜儀: 納流速超高效液相色譜EASY-nLC 1000(Thermo, 美國); 色譜柱: 納流C18EASY-Spray柱(2 μm, 100 Å, 75 μm×25 cm/50 cm), 流速250nL/min; 自制納流C18柱(3 μm, 100 Å, 75 μm×15 cm), 流速300nL/min; 流動(dòng)相A: 0.1%甲酸-水溶液;流動(dòng)相B: 0.1%甲酸-乙腈溶液.

 

50min有效梯度: 0~2min, 3%~5% B; 2~42min, 5%~22% B; 42~52min, 22%~30% B; 52~55min, 30%~90% B; 55~60min, 90% B. 70min有效梯度: 0~5 min, 3%~8% B; 5~60min, 8%~20% B; 60~75min, 20%~30% B; 75~80min, 30%~90% B; 80~90min, 90% B.

 

1.3 質(zhì)譜方法

質(zhì)譜儀: Orbitrap Fusion(Q-OT-qIT)高分辨質(zhì)譜儀(ThermoFisher, 美國); 離子源: EASY-Spray或Nanospray Flex納升電噴霧源; 噴霧電壓: 2.2 kV; 離子傳輸管溫度: 275℃; RF-lens: 60%.

掃描模式: Top-speed; 循環(huán)時(shí)間: 3 s; 動(dòng)態(tài)排除: 60 s.

一級(jí)掃描: 質(zhì)量分析器,軌道阱; 掃描范圍,m/z350~1800; 分辨率,120k; 最大注入時(shí)間,50 ms; 自動(dòng)增益控制(AGC): 2e5.

二級(jí)IT掃描: 離子選擇,四級(jí)桿; 選擇窗口,2 amu; 質(zhì)量分析器,離子阱(ion trap, IT); 掃描速度,Rapid; 最大注入時(shí)間,35 ms; AGC: 1e4; 碎裂模式,HCD; 碎裂能量, 35%.

二級(jí)OT掃描: 離子選擇,四級(jí)桿; 選擇窗口,2 amu; 質(zhì)量分析器,軌道阱; 分辨率,15k; 最大注入時(shí)間,35 ms; AGC,1e5; 碎裂模式,HCD; 碎裂能量, 35%.

 

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 1.4軟件搜庫鑒定. 搜索引擎: SEQUEST HT; 數(shù)據(jù)庫: Uniprot人和酵母蛋白數(shù)據(jù)庫; 蛋白酶: 胰蛋白酶(full); 最大漏切位點(diǎn): 2; 母離子質(zhì)量精度: 10 ppm; 子離子質(zhì)量精度: 0.6 Da(qIT)/0.02 Da(OT); 固定修飾: Carbamidomethyl(C+57.021 Da); 可變修飾: acetyl(N-terminus+42.011 Da), deamidated(N, Q+0.984 Da), oxidation(M+15.995 Da). 搜庫結(jié)果使用Percolator計(jì)算q值進(jìn)行卡值. 同時(shí), 使用Preview軟件分析數(shù)據(jù)質(zhì)量.

 

2.1 Q-OT-qIT短梯度分析HeLa和酵母蛋白質(zhì)組

實(shí)驗(yàn)對(duì)1 μg和50 ng HeLa進(jìn)行50min有效梯度采集, 對(duì)1 μg酵母全蛋白進(jìn)行70min有效梯度采集, 采用OT-HCD-IT掃描模式, 一級(jí)軌道阱、二級(jí)離子阱掃描, HCD高能碎裂. 結(jié)果顯示, 有效出峰時(shí)間蛋白酶解產(chǎn)物得到充分分離, 質(zhì)譜響應(yīng)良好(圖1). 即使在50 ng的極低樣本量下, 仍獲得良好的分離效果和質(zhì)譜響應(yīng)(圖1B).

 

1 μg HeLa樣本在50min有效梯度內(nèi)共獲得53209張譜圖, 平均每秒1.7張一級(jí)譜圖、16.1張二級(jí)譜圖, 平均每循環(huán)9.6張二級(jí)譜圖; 酵母樣本在70min有效梯度內(nèi)共獲得60295張譜圖, 平均每秒1.8張一級(jí)譜圖、12.5張二級(jí)譜圖, 平均每循環(huán)6.9張二級(jí)譜圖(表1). HeLa細(xì)胞比酵母復(fù)雜, 存在更多的蛋白, 因此獲得更多的二級(jí)譜圖. 此外, 在50 ng HeLa的極低樣本量下, 總譜圖數(shù)也達(dá)到41099張.

 

圖1 HeLa和酵母蛋白酶解產(chǎn)物的LC-MS/MS總離子流圖

A: 1 μg HeLa; B: 50 ng HeLa; C: 1 μg酵母

 

 

2.2 HeLa和酵母蛋白質(zhì)組快速鑒定結(jié)果

數(shù)據(jù)經(jīng)SEQUEST HT搜庫和Percolator卡值, 從1 μg和50 ng HeLa樣本中分別鑒定到20860和14100條肽段(q值0.01), 分別對(duì)應(yīng)3865和2877個(gè)非冗余蛋白(表2), 而同樣的鑒定數(shù)量, 目前的報(bào)道至少需要2~3h[9]. 另外, 酵母樣本共鑒定到15083條肽段(q值0.01), 對(duì)應(yīng)2697個(gè)非冗余蛋白(表2).

 

HeLa數(shù)據(jù)進(jìn)一步使用Preview軟件分析譜圖質(zhì)量精度(圖2). 結(jié)果顯示, 母離子(m/z)質(zhì)量精度平均為0 ppm, 子離子質(zhì)量精度(m/z)平均為0.075 Da. 軌道肼質(zhì)量偏差基本保持在5 ppm以內(nèi), 具有高質(zhì)量精度和長(zhǎng)期穩(wěn)定的質(zhì)量軸; 離子阱質(zhì)量偏差基本保持在±0.2 Da以內(nèi), 質(zhì)量精度良好, 保證了數(shù)據(jù)的質(zhì)量與結(jié)果可信度.

 

肽段ATAGDTHLGGEDFDNR的譜圖展示了Q-OT-qIT質(zhì)譜的碎裂效果和靈敏度(圖3), 譜圖具有豐富的碎片信息、良好的匹配度和較高的靈敏度. 此外, HCD和CID兩種碎裂模式效果相當(dāng)并有著各自的特點(diǎn): HCD避免了CID的三分之一效應(yīng), 低分子量端信息沒有丟失, 同時(shí)速度比CID快5%; 而CID靈敏度更高, 對(duì)低豐度肽段碎裂效果更明顯.

 

2.3 不同碎裂模式和檢測(cè)方法比較與分析

鑒于不同模式的鑒定效果差異明顯, 實(shí)驗(yàn)深入考察了HCD/CID碎裂模式和軌道阱/離子阱二級(jí)檢測(cè)方法對(duì)鑒定結(jié)果的影響. 首先分析了HeLa在OT-HCD-IT, OT-CID-IT和OT-HCD-OT3種模式下的鑒定結(jié)果, 比較其互補(bǔ)性. 結(jié)果表明, HCD和CID共同鑒定到的肽段占32.7%, 僅一種碎裂模式鑒定到的占67.3%; OT/IT同時(shí)檢測(cè)到的肽段占51.9%, 僅一種質(zhì)量分析器檢測(cè)到的占48.1%(圖4). CID有三分之一效應(yīng), 造成低分子量端的質(zhì)量歧視, HCD克服了低質(zhì)量端歧視, 但靈敏度略低于CID; 離子阱具有較高的掃描速度和靈敏度, 而軌道阱的高分辨率與高質(zhì)量精度有效排除了復(fù)雜樣本基質(zhì)的干擾. 因此, 兩種碎裂模式和檢測(cè)方法具有一定的互補(bǔ)性.

 

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步使用OT-HCD-IT, OT-CID-IT, OT-HCD-OT和OT-CID-OT4種掃描模式, 對(duì)酵母樣本進(jìn)行60 min有效梯度采集, 詳細(xì)比較了不同掃描模式的差異. 其中, 二級(jí)IT采用Rapid掃描, OT采用30k分辨率. 鑒定結(jié)果以O(shè)T-HCD-IT結(jié)果為100%歸一化(圖5). 結(jié)果表明, 由于OT-HCD-IT速度最快, 獲得的譜圖數(shù)和鑒定結(jié)果最多; CID比HCD慢5%, 因此鑒定結(jié)果少5%; OT-HCD-OT為兩級(jí)高分辨, 一級(jí)、二級(jí)無法同時(shí)運(yùn)行, 譜圖數(shù)和蛋白鑒定數(shù)分別是二級(jí)IT掃描的70%和85%; OT-CID-OT速度最慢, 譜圖數(shù)和蛋白鑒定數(shù)分別是OT-HCD-IT的60%和75%. 此外, 4種掃描模式的譜圖解析率相差不大, 表明不同掃描模式對(duì)數(shù)據(jù)質(zhì)量影響不大.

 

2.4 離子最大注入時(shí)間與自動(dòng)增益控制(AGC)對(duì)結(jié)果的影響

利用C-trap控制離子的注入時(shí)間和注入數(shù)量(自動(dòng)增益控制)是軌道阱質(zhì)量分析器的特點(diǎn), 進(jìn)入軌道阱的離子數(shù)量對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響很大, 合適的離子數(shù)量不僅避免了空間電荷效應(yīng), 還能夠明顯提升譜圖質(zhì)量、動(dòng)態(tài)線性范圍和檢測(cè)線. 實(shí)驗(yàn)在OT-HCD-OT模式下設(shè)置不同參數(shù)對(duì)HeLa樣本進(jìn)行分析(二級(jí)OT采用15k分辨率), 進(jìn)一步探索不同的最大注入時(shí)間和AGC設(shè)置對(duì)結(jié)果的影響(表2).

 

鑒定結(jié)果表明, 當(dāng)樣本濃度較高(1 μg)時(shí), 離子數(shù)量充足, 較小的注入時(shí)間和AGC即可獲得良好的結(jié)果;增加注入時(shí)間和AGC反而會(huì)降低掃描速度, 減少譜圖數(shù)量.因此, 參數(shù)設(shè)置為1.0e5, 35 ms時(shí)獲得的鑒定數(shù)最多(圖6A). 當(dāng)樣本濃度很低(50 ng HeLa)時(shí), 需要增加注入時(shí)間和AGC以注入更多的離子, 提高靈敏度和譜圖質(zhì)量; 但如果注入時(shí)間過長(zhǎng)(120和200ms), 譜圖數(shù)量太少, 也會(huì)導(dǎo)致鑒定結(jié)果減少.因此, 2.0e5, 60 ms的參數(shù)設(shè)置獲得的鑒定數(shù)最多(圖6B). 此外, 注入時(shí)間越長(zhǎng)、離子數(shù)量越多, 譜圖質(zhì)量越高, 因此, 離子注入數(shù)量與譜圖解析率成正比.

 

A: 一級(jí)質(zhì)量精度; B: 二級(jí)質(zhì)量精度

 

 

A: 1 μg樣本量, CID碎裂; B: 1 μg樣本量, HCD碎裂; C: 50 ng樣本量, HCD碎裂

 

A: HCD和CID碎裂模式比較; B: 離子阱和軌道阱二級(jí)檢測(cè)比較

 

以O(shè)T-HCD-IT為100%歸一化

 

圖6 不同的最大離子注入時(shí)間和AGC結(jié)果比較

A: 1 μg HeLa結(jié)果比較; B: 50 ng HeLa結(jié)果比較. 以每項(xiàng)最高值為100%

 

3 討論

隨著“一小時(shí)酵母蛋白質(zhì)組”全覆蓋的實(shí)現(xiàn), 蛋白質(zhì)組深度覆蓋研究迎來新的時(shí)代[6]. 在復(fù)雜樣本蛋白質(zhì)組研究中, 傳統(tǒng)方法需要進(jìn)行二維分離、分級(jí)的方式簡(jiǎn)化樣本、充分分離, 這樣不僅操作費(fèi)力, 也需消耗大量的時(shí)間. 而Q-OT-qIT質(zhì)譜技術(shù)使得在60 min左右一維短梯度下實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣本的深度鑒定成為現(xiàn)實(shí).

 

Q-OT-qIT的三合一結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)質(zhì)譜難以實(shí)現(xiàn)的并列運(yùn)行, 即一級(jí)、二級(jí)掃描同時(shí)進(jìn)行, 離子注入、選擇、碎裂、檢測(cè)同時(shí)進(jìn)行(圖7). 動(dòng)態(tài)掃描管理技術(shù)自動(dòng)控制和實(shí)時(shí)優(yōu)化儀器運(yùn)行, 使3種質(zhì)量分析器相互配合、同時(shí)工作, 盡可能減少掃描過程和循環(huán)間隙的等待時(shí)間. “減一邏輯”將二級(jí)掃描與上一次一級(jí)掃描相關(guān)聯(lián), 無需等待本次一級(jí)掃描確定母離子及電荷, 提高儀器運(yùn)行速度和分析效率. 以top 10的數(shù)據(jù)依賴掃描(DDA)為例, 240k分辨率下, 當(dāng)一級(jí)全掃描完成時(shí), 所有二級(jí)掃描也同時(shí)完成, 一級(jí)、二級(jí)互不相關(guān)、獨(dú)立運(yùn)行(圖7). 此外, top-speed模式在固定時(shí)間內(nèi)盡可能多地激發(fā)二級(jí)掃描, 相比傳統(tǒng)Top-N模式能更多地采集低豐度肽段, 也保證了一級(jí)掃描點(diǎn)數(shù), 有利于同時(shí)定性定量.

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 1 μgHeLa樣本在50 min有效梯度內(nèi)采集到53209張譜圖, 掃描速度為17.7 Hz, 其中包括120k分辨率的一級(jí)軌道阱掃描, 并列運(yùn)行的工作模式提高了儀器整體運(yùn)行速度. 在嚴(yán)格卡值(1% FDR)下, 鑒定到20860條非冗余肽和3865個(gè)非冗余蛋白, 而最新的文獻(xiàn)報(bào)道需要至少2~3h才能達(dá)到相同結(jié)果[9]. 酵母樣本雖未達(dá)到Hebert等人[6]報(bào)道的蛋白鑒定數(shù)量, 但上樣量更低, 并且未進(jìn)行重復(fù), 比目前其他儀器的報(bào)道結(jié)果也有2倍以上的提高[8,9]. 在掃描速度方面, Q-OT-qIT雖然未達(dá)到Q-TOF類質(zhì)譜的極限速度, 但譜圖質(zhì)量更高, 譜圖解析率比Q-TOF類質(zhì)譜高2~3倍[8].

 

1 μgHeLa樣本在多次實(shí)驗(yàn)中的譜圖解析率基本達(dá)到60%以上, 在加大離子注入時(shí)間和注入數(shù)量的情況下甚至達(dá)到83.1%(表3), 顯示了良好的譜圖質(zhì)量. 全蛋白樣本體系復(fù)雜, 短梯度下會(huì)有共流出肽段和基質(zhì)雜質(zhì)的干擾, 大量低豐度肽段的二級(jí)響應(yīng)也很弱, 在這樣的情況下, 譜圖解析率達(dá)到80%以上, 顯著高于目前的文獻(xiàn)報(bào)道[8,9]. 此外, 樣本量決定了蛋白鑒定數(shù)量, 傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)分析需要微克級(jí)的全蛋白, 而本實(shí)驗(yàn)嘗試將樣本量降低到納克級(jí), 即50 ng上樣量, 鑒定結(jié)果已達(dá)到目前微克級(jí)的水平, 為低濃度樣本和極低豐度蛋白分析提供可能.

 

Q-OT-qIT的三合一結(jié)構(gòu)使掃描方式靈活多樣. C-trap與離子阱之間的多極離子通道使離子可以正反向自由移動(dòng), 實(shí)現(xiàn)了CID/HCD/ETD3種碎裂模式在MSn任意一級(jí)使用, 并任意使用軌道阱或離子阱檢測(cè), 產(chǎn)生多種組合的掃描模式. 其中, CID碎裂相比HCD靈敏度略高, 但是速度略慢, 且有三分之一效應(yīng), 即低質(zhì)量端歧視, 而HCD在低分子量段具有豐富的碎片信息; 軌道阱的超高分辨率與質(zhì)量精度可以最大程度地排除干擾, 而離子阱速度更快, 并且可以和軌道阱同時(shí)運(yùn)行, 提高效率. 可見, 由于機(jī)理的不同, 各種掃描模式的效果不同, 具有一定的互補(bǔ)性. Q-OT-qIT控制離子注入時(shí)間和注入數(shù)量的能力也是保證分析效率和靈敏度的重要因素. 注入時(shí)間越長(zhǎng)、注入數(shù)量越多, 則靈敏度越高、譜圖質(zhì)量越高, 但掃描速度越慢; 相反, 離子注入數(shù)量越少, 速度越快, 但低豐度離子損失越大, 靈敏度下降. 可見, 實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆颖静煌?適合的掃描模式和參數(shù)也不同, 因此, 實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了掃描模式和離子注入?yún)��?shù)對(duì)結(jié)果的影響.

 

結(jié)果表明, 不同碎裂模式和檢測(cè)方法均具有良好的互補(bǔ)性. 軌道阱和離子阱之間有1/2的鑒定結(jié)果不重復(fù), HCD和CID之間有2/3結(jié)果不重復(fù), 不同的掃描方法結(jié)合可以達(dá)到更大的覆蓋范圍. 另一方面, 線性離子阱相比傳統(tǒng)離子阱質(zhì)量精度更高, 質(zhì)量偏差穩(wěn)定保持在0.2 Da以內(nèi), 達(dá)到中高分辨質(zhì)譜水平, 因此, OT和IT掃描均具有較高的譜圖解析率. 在離子控制方面, 通過提高最大注入時(shí)間和最大注入數(shù)量, 可以增加離子注入量, 提高低濃度樣本和極低豐度蛋白的靈敏度; 而降低離子注入量, 能夠加快常規(guī)樣本的分析速度、增加鑒定數(shù)量. 通過幾種模式和參數(shù)的考察、優(yōu)化, 為蛋白質(zhì)組快速分析和深度覆蓋研究提供了更多選擇.

 

4 結(jié)論

本文利用Q-OT-qIT三合一質(zhì)譜, 對(duì)HeLa和酵母全蛋白進(jìn)行了短梯度快速鑒定: (ⅰ) 50 min有效梯度, 從1 μgHeLa中鑒定到20860條非冗余肽和3865個(gè)非冗余蛋白, 時(shí)間相比目前的報(bào)道縮短了50%~60%; (ⅱ) 50 ng極低樣本量, 鑒定到14100條非冗余肽和2877個(gè)非冗余蛋白, 譜圖解析率超過50%; (ⅲ) 考察了HCD/CID碎裂模式和IT/OT檢測(cè)方法的異同, 結(jié)果顯示, 不同方法間互補(bǔ)性良好, 并且均有較高的譜圖解析率; (ⅳ) 考察了離子最大注入時(shí)間和自動(dòng)增益控制對(duì)結(jié)果的影響, 表明提高注入時(shí)間和注入數(shù)量可以顯著提高低濃度樣本的檢測(cè)靈敏度. 綜上所述, 基于Q-OT-qIT質(zhì)譜, 本文實(shí)現(xiàn)了短時(shí)間內(nèi)對(duì)復(fù)雜樣本蛋白質(zhì)組深度覆蓋分析, “一小時(shí)蛋白質(zhì)組”時(shí)代已經(jīng)到來.

 

軌道阱一級(jí)全掃描的同時(shí), 四極桿依次進(jìn)行若干母離子選擇, 離子阱依次進(jìn)行若干母離子的二級(jí)碎片掃描, 三者同時(shí)運(yùn)行

 

致謝 部分圖片素材由賽默飛世爾科技圣何塞工廠提供.

 

 

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4 Geiger T, Wehner A, Schaab C, etal. Comparative proteomic analysis of eleven common cell lines reveals ubiquitous but varying expression of most proteins. Mol Cell Proteomics, 2012, 11: M111.014050

5 Senko M W, Remes P M, Canterbury J D, et al. Novel parallelized quadrupole/linear ion trap/orbitrap tribrid mass spectrometer improving proteome coverage and peptide identification rates. Anal Chem, 2013, 85: 11710–11714

6 Hebert A S, Richards A L, Bailey D J, et al. The one hour yeast proteome. Mol Cell Proteomics, 2013: M113.034769

7 Nagaraj N, Kulak N A, Cox J, et al. System-wide perturbation analysis with nearly complete coverage of the yeast proteome by single-shot ultra HPLC runs on a bench top orbitrap. Mol Cell Proteomics, 2012, 11: M111.013722

8 Andrews G L, Simons B L, Young J B, et al. Performance characteristics of a new hybrid quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometer (TripleTOF 5600). Anal Chem, 2011, 83: 5442–5446

9 Kelstrup C D, Young C, Lavallee, R, et al. Optimized fast and sensitive acquisition methods for shotgun proteomics on a quadrupole orbitrap mass spectrometer. J Proteome Res, 2012, 11: 3487–3497

 

 

ZHANG Wei, GU PeiMing, JIANG Zheng, MING Hong & CHEN Wei

 

 

With the realization of “the one hour yeast proteome”, in-deep proteome under rapid LC-MS/MS gradient is achieved. The current study utilized novel Q-OT-qIT mass spectrometer to analyze and optimize “the one hour proteome”. Within 50 min LC-MS/MS gradient, a total of 20860 and 14100 unique peptides were identified from 1 μg and 50 ng HeLa digest, corresponding to 3865 and 2877 proteins, respectively. Similar result from current reports used at least 2–3 h gradient. The effect of various collision modes, detectors, maximum injection times and automatic gain control settings were further evaluated, and the complementarity between different acquisition methods and scan parameters were described. Moreover, the massive parallelization of Q-OT-qIT was discussed, providing useful information for rapid proteome analysis.

 

 

doi: 10.1360/10.1360/052014-16