前言

雜質(zhì)分析對于藥物的研發(fā)至關(guān)重要 1。在研究過程中，雜質(zhì)譜信息能幫助藥物化學(xué)家優(yōu)化合成路線和避免潛在的有毒雜質(zhì)。在開發(fā)過程中，當(dāng)大量母體化合物存在時，鑒定和表征痕量雜質(zhì)至關(guān)重要，從而促進(jìn)了高分辨率、高靈敏度和高掃描速度的 HR-MS 儀器和智能化結(jié)構(gòu)鑒定軟件的發(fā)展。

為了展示 HR-MS 在雜質(zhì)分析和結(jié)構(gòu)鑒定方面的能力，本文選用了市售藥物奧美拉唑。本研究采用了賽默飛世爾科技的 Q Exactive Focus 臺式 Orbitrap 質(zhì)譜儀和數(shù)據(jù)處理軟件 Mass Frontier 來快速分析和鑒定奧美拉唑中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)。

方法

材料與試劑

奧美拉唑（CAS# 73590-58-6）購自 Sigma-Aldrich，
產(chǎn)品號 O104-100MG。
乙腈和水來自 Fisher Scientific
乙酸銨購自 Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號 73594-25G-F。
甲酸購自 Sigma-Aldrich，產(chǎn)品號 33015-500ml。

樣品前處理

奧美拉唑溶液（0.5 mg/mL）配制在 1:1 乙腈 / 水混合溶劑中。

HPLC 方法

色譜分離采用Thermo Scientific Ultimate3000 UHPLC系統(tǒng)。
色譜柱： Thermo Scientific Hypersil GOLD 柱，2.1mm×150mm，粒徑 3 μm.
柱溫： 35 ℃，流速： 0.5 mL/min，進(jìn)樣體積： 8 μL
流動相： A - 水； B - 乙腈； C -100 mM 乙酸銨，用乙酸調(diào)節(jié) pH 值到 5
梯度洗脫：

質(zhì)譜方法

質(zhì)譜分析采用 Thermo Scientific Q Exactive Focus 質(zhì)譜儀的電噴霧正離子模式。在 70,000 和 35,000 分辨率 FWHM@m/z 200 下分別采集高分辨全掃描一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)依賴二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

離子源條件：
離子化模式：正離子 ESI
離子源： HESI-II
鞘氣流速： 45 單位 N2
輔助氣流速： 10 單位 N2
噴霧電壓（KV）： +3.5
毛細(xì)管柱溫度（℃）： 320
S-lens RF 水平： 50.0
加熱器溫度（℃）： 400
Q Exactive Focus 方法參數(shù)：
AGC 目標(biāo)（全掃描）： 3e6
AGC 目標(biāo)（MS/MS）： 1e5
碰撞能量： 30， 35% 階梯變化
掃描范圍（全掃描 MS）： 180 到 1200 amu

結(jié)果與討論

I. 高分辨率全掃描 -HCD MS/MS 鑒定雜質(zhì)

采集得到奧美拉唑的高分辨率全掃描和三個最高強度的數(shù)據(jù)依賴 HCD MS/MS 數(shù)據(jù)。 HRAM 全掃描和MS/MS 數(shù)據(jù)提供了分子量和碎片信息。 HCD（高能量碰撞解離）得到了豐富的 MS/MS 碎片和低質(zhì)量端碎片信息。利用 Mass Frontier 軟件與這些信息互相配合，我們不僅快速檢測出奧美拉唑的主要雜質(zhì)，而且可靠地測定了相應(yīng)的元素組成，如圖 1&2 和表 1所示。

II. Mass Frontier 用于未知物的結(jié)構(gòu)鑒定

采用Mass Frontier 的“碎片離子搜索”（FISh）功能處理HRAM 全掃描和 MS/MS 數(shù)據(jù)，見圖 3-a。 FISh 能輕易識別出與母體化合物具有相同碎片離子的化合物，見圖 3-b，并根據(jù)碎片推斷出可能的雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，見圖 7。通過搜索 Mass Frontier的 HighChem 譜 圖 數(shù) 據(jù) 庫， Mass Frontier 的“ Fragment and Mechanism（碎片和機理）”功能可以提供推薦結(jié)構(gòu)的參考文獻(xiàn)。每個推薦結(jié)構(gòu)的“ Fragment and Mechanism”結(jié)果對于理解結(jié)構(gòu)來源提供了很好的幫助。將數(shù)據(jù)結(jié)果與“ Fragment andMechanism”進(jìn)行比較，為推薦結(jié)構(gòu)提供了更多的確認(rèn) / 否定標(biāo)準(zhǔn)。

Mass Frontier 的另一個重要特色是“碎片結(jié)構(gòu)的注解圖譜”，用于碎片的自動預(yù)測。三個同分異構(gòu)體的結(jié)構(gòu)鑒定演示了這個功能，見圖 4 和 5。

結(jié)論

Q Exactive Focus 臺式 Orbitrap 系統(tǒng)能實現(xiàn)全掃描和 MS/MS 數(shù)據(jù)的高分辨率準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)測定（HRAM），為未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定提供至關(guān)重要的分子量和結(jié)構(gòu)信息： HRAM 全掃描準(zhǔn)確測定元素組成，而 HRAM MS/MS 能準(zhǔn)確測定雜質(zhì)成分。

Mass Frontier 碎片離子搜索（FISh）和Fragment andMechanism功能，通過搜索 HighChem 碎片數(shù)據(jù)庫準(zhǔn)確鑒定未知物的結(jié)構(gòu)。

由 Q Exactive Focus HRAM 數(shù)據(jù)和 Mass Frontier 軟件組成的工作流程能幫助研究人員在藥物研究的早期高效準(zhǔn)確地鑒定每批次 API 中的雜質(zhì)。

參考文獻(xiàn)

1. FDD Guidance for Industry, Q3A (R2) Impurities in New Drug Substances