張曉夕1,Yue Xuan2, 李靜1，顧培明1，吳澤明1，Application Group, LC-MS, CMD, Japan3

1 賽默飛世爾科技（中國）有限公司

2 Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany

3 Thermo Fisher Scientific, Yokohama, Japan

 

在最近十年中，非變性質譜（Native mass spectrometry） 正在逐漸成為非共價結合的完整蛋白復合物表征的重要技術手段 [1]。對于完整單克隆抗體（mAbs），非變性質譜可提供分子量、糖型等的精確測量結果，還可用于高級結構（二聚、三聚和四聚）的測定；非變性質譜正在成為一種具有穩(wěn)健性、快速且可靠的一線分析表征工具[2,3]。

 

賽默飛世爾科技在2013 年國際HUPO 大會上發(fā)布的Thermo ScientificTM ExactiveTM Plus EMR 質譜儀結合了無以倫比的高分辨率精確質量Thermo ScientificTM OrbitrapTM 分析和擴展質量數(shù)范圍（EMR）功能，提供了一個出色的工具，用于研究類似天然狀態(tài)下保留有三級和四級結構的蛋白質和蛋白質復合物的結構學、拓撲學和構造�？捎糜趩慰寺】贵w的純度、PEG 修飾的蛋白質、低聚蛋白藥物、糖型和組裝蛋白質的表征。同時，Exactive Plus EMR 質譜儀的全面分析性能使之成為篩查多肽和小分子的最佳解決方案。

 

EMR 對Exactive Plus 系統(tǒng)的升級體現(xiàn)在：

擴展的質量數(shù)范圍m/z 350-20,000；高質量數(shù)離子的傳輸效率更高，提升信號強度；改進的HCD 壓力和控制，更容易優(yōu)化實驗條件；能夠捕捉更短時間的時域信號，提高信噪比。

 

圖1 配備Advion Inc. TriVersa NanoMate^® 芯片電噴霧離子源的Exactive Plus EMR

 

使用單抗分子量測試標準品（Waters 186006552），按Micro Bio-Spin® Columns（BIO-RAD）標準操作步驟將單抗溶液體系置換為100mM NH₄Ac，單抗樣品濃度為10μM。

 

 

 

質譜條件
儀器	Exactive Plus EMR Orbitrap MS system（圖1）
Mass Range	350-20000
Resolution	8750, 17500, 35000, 70000, 140000
Micro scans	10
Insource CID energy（eV）	100-200，根據(jù)具體實驗條件分別優(yōu)化
S-lens level（%）	200
Trapping gas pressure setting factor	3
Spectra average	100

 

使用Protein Deconvolution 2.0SP2進行去卷積分析。

 

對于單抗標準品分子量測試，分別采用不同分辨率（8750,17500,35000,70000,140000）測定其在非變性條件下的分子量（圖2）。

 

Exactive Plus EMR總共具有五檔不同的分辨率，供不同分析目的使用。從上圖中不難看出，首先，由于在非變性狀態(tài)下蛋白質樣品更不易帶電，與變性條件下相比，150kDa的單克隆抗體出峰在m/z 5000-8000的范圍內，明顯向高質量端移動。Exactive Plus EMR的m/z上限拓展至20000，可輕松勝任非變性條件下單克隆抗體乃至其多聚體的分析需求。其次，即使在最低分辨率下，仍能采集到高信噪比、基線干凈的譜圖，證明了Orbitrap系統(tǒng)所具有的高靈敏度、高質量精度和高穩(wěn)定性等優(yōu)點可以生成高質量、高可信度的原始數(shù)據(jù)。

 

從圖3中可以看出，當使用最低一檔分辨率（8750）時，單克隆抗體的不同糖型之間無法得到分離，通過解卷積結果也可以發(fā)現(xiàn)，其結果與標準分子量有較大差距。這證明當分辨率不夠高時，由于測量精確度不夠，造成解卷積結果與標準分子量差距較大。

 

 

圖2 在不同分辨率下測定單抗分子量測試標準品分子量

 

 

圖3 8750分辨率下單抗標準品分子量測定結果

 

 

圖4 35000分辨率下單抗分子量測試標準品分子量測定結果

 

圖4為35000分辨率下對單抗標準品分子量測定的原始譜圖和解卷積譜圖。從原始譜圖中可以看出，單克隆抗體的不同糖型得到了完全基線分離，譜圖干凈、信噪比高。觀察解卷積后的譜圖可以發(fā)現(xiàn)，當測量精確度提高時，樣品的質量精度得到了飛躍性的提高。

 

圖5展示了在140000分辨率下對單抗標準品分子量測定的結果。從圖中可以看出，當采用最高分辨率——140000進行分析時，許多在低分辨率下無法得到的峰都得到了解析。在保持高分辨率的同時，Exactive Plus EMR仍具有極高的靈敏度和質量精度，對于150kDa的完整單克隆抗體，主要糖型的質量偏差均在1.5Da之內（外標校正）。

 

圖5 140000分辨率下單抗分子量測試標準品分子量測定結果

 

在本實驗中，我們使用Exactive Plus EMR高分辨質譜對非變性狀態(tài)下的單克隆抗體進行了分子量測定。結果表明，Orbitrap系統(tǒng)可以實現(xiàn)單抗不同糖型之間的基線分離，在保持高靈敏度、高質量精度的同時獲得雜質與樣品峰清晰基線分離、高信噪比的譜圖。

 

從實驗結果中還可觀察到，基于Orbitrap技術的Exactive Plus EMR高分辨質譜提供了多檔分辨率供選擇，當分辨率過低不足以將不同修飾的質譜峰分開時，可通過提高分辨率將其分開，從而獲得高精度、高可信度的結果。

 

基于Exactive Plus EMR的非變性質譜技術不僅可以用于單克隆抗體分子量測定，還可用于非變性狀態(tài)下ADC藥物的藥-抗體比率（DAR）測定、抗原-抗體結合比測定及蛋白復合物分析等，具有廣闊的應用前景。

 

1 Heck, A. J. Nat. Methods 2008, 5, 927-933.

2 Beck, A. et al., TrAC2013, 48, 81-95.

3 Beck, A. et al., Anal. Chem. 2013, 85, 715-36.