關(guān)鍵詞
Q Exactive Plus，Q Exactive HF，TMT，Proteome Discoverer 2.1，蛋白質(zhì)鑒定，相對(duì)定量，同量異序標(biāo)簽，多重定量

研究目標(biāo)
在 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM 儀器平臺(tái)上，采用 Thermo ScientificTM TMTsixplexTM 和 TMT10plexTM 工作流程，建立最優(yōu)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集方法將其應(yīng)用于蛋白質(zhì)的相對(duì)定量研究中。本文詳細(xì)介紹了該工作流程所涉及的樣品前處理、肽段分離和質(zhì)譜分析等過程，以及采用 Thermo ScientificTM Proteome DiscovererTM 軟件 2.1 版本對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析的具體流程。

背景介紹
同量異序標(biāo)簽（如 Tandem Mass 標(biāo)簽TM （TMTTM）1 或 isobaric Tag for Relative and Absolute Quantification（iTRAQ®）2）是基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)相對(duì)定量方法中非常常見的一種。3-6 其中，基于 TMT 標(biāo)簽的多重相對(duì)定量方法具有很多優(yōu)勢(shì)，包括整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期更短、波動(dòng)更小，樣品通量更高，以及樣品間定量數(shù)據(jù)的缺失更少等。標(biāo)記氨基的 TMT10plex 與 TMTsixplex 反應(yīng)試劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)相同但是前者在質(zhì)量報(bào)告區(qū)域中可以提供更多的 13C 和 15N 同位素組合形式。對(duì)于某些組合間彼此僅相差一個(gè)中子的質(zhì)量，需要高分辨率的分析儀器實(shí)現(xiàn)串聯(lián)質(zhì)譜譜圖采集才能進(jìn)行區(qū)分。

Thermo ScientificTM TribridTM 質(zhì)譜儀家族，包括 OrbitrapTM FusionTM MS 和 Orbitrap Fusion LumosTM MS 儀器，所提供的同步母離子選擇（SPS）MS3 方法能夠在具有高動(dòng)態(tài)范圍的復(fù)雜樣品中實(shí)現(xiàn)最為準(zhǔn)確的 TMT 定量分析。7，8 而 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM 質(zhì)譜儀系列儀器，結(jié)合了四極桿對(duì)母離子選擇的高選擇性和高特異性與 Orbitrap 質(zhì)量分析器的高分辨率和準(zhǔn)確質(zhì)量（HRAM）檢測(cè)能力的優(yōu)勢(shì)，也是進(jìn)行同量異序定量分析的一把好手。Thermo ScientificTM Q ExactiveTM Plus 質(zhì)譜儀通過配備改進(jìn)的四極桿技術(shù)（AQT）以優(yōu)化離子選擇能力和傳輸效果，同時(shí)提高了在窄小的隔離窗口內(nèi)對(duì)低豐度離子進(jìn)行定量分析的能力。9 Thermo ScientificTM Q ExactiveTM HF 質(zhì)譜儀引入了超高場(chǎng) Orbitrap 質(zhì)量分析器，能夠以兩倍于 Q Exactive Plus MS 的掃描速度實(shí)現(xiàn)高分辨率檢測(cè)，表現(xiàn)出了更為優(yōu)異的性能。9

基于 Q Exactive 質(zhì)譜儀的 TMT 標(biāo)記定量分析流程，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)肽段和蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果的最大化，而且能夠同時(shí)為多達(dá)十個(gè)不同樣品提供高定量準(zhǔn)確度的相對(duì)定量結(jié)果。該流程的前提是需要良好的色譜分離效果、充分分辨的質(zhì)譜峰、足夠的離子豐度，以及能以高掃描速度采集高質(zhì)量的 MS2 碎裂譜圖。本應(yīng)用文檔為 TMT 標(biāo)記及其相對(duì)定量策略提供了詳細(xì)的分步指導(dǎo)，包含樣品前處理、儀器設(shè)置，以及采用 Thermo ScientificTM Proteome DiscovererTM 2.1 軟件對(duì)多重定量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。本文詳細(xì)討論了關(guān)鍵儀器參數(shù)（分辨能力、最大注入時(shí)間、自動(dòng)增益目標(biāo)值、碰撞能量和隔離窗口等）對(duì)蛋白質(zhì)和肽段鑒定以及定量結(jié)果的影響，以保證用戶能夠參照本文成功地在 Q Exactive 系列質(zhì)譜儀上建立 TMT 定量工作流程。

實(shí)驗(yàn)方法

TMT 標(biāo)記
采用 Thermo Scientific TMT 試劑對(duì) E. coli 酶解產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品（Waters® Corp，Milford，MA）按如下步驟進(jìn)行標(biāo)記：
1. 將三乙胺碳酸鹽 （TEAB） 緩沖液、TMT 標(biāo)簽和干粉狀態(tài)下的樣品從 -20 ℃ 轉(zhuǎn)移至室溫下平衡。
2. 將 500 μL 溶解緩沖液 （Dissolution Buffer，1 M TEAB） 加入到 4.5 mL 超純水中，制備 100 mM TEAB 溶液。
3. 將單個(gè)樣品（不超過 100 μg/TMT 標(biāo)簽） 溶于 100 mM TEAB 緩沖液，得到 1 μg/uL 的樣品溶液，充分渦旋振蕩，放置 10 分鐘。
4. 在每個(gè) TMT 試劑瓶中加入 41 μL 新鮮 LC-MS 級(jí)乙腈，充分渦旋振蕩，放置 10 分鐘。
5. 在每個(gè) TMT 試劑瓶中加入不高于 100 μL 第 3 步中制備的樣品溶液，渦旋振蕩，孵育 1 小時(shí)。
6. 反應(yīng) 1 小時(shí)后，向每個(gè)小瓶中加入 8 μL 5% 羥胺（將試劑盒中提供的 50% 羥胺儲(chǔ)備液用水稀釋 10 倍）以終止反應(yīng)，孵育 15 分鐘。
7.標(biāo)記結(jié)束后，立即按所需比例混合不同樣品。在本研究中，TMTsixplex 試劑（通道 126-131）的混合比例為 20:10:1:1:10:20。所選六種 TMT10plex 試劑（通道 127C，128N，128C，129N，129C，130N）以相同比例混合。
8. 將制備好的樣品分成小份，干燥，在 -80 ℃ 下儲(chǔ)存。
9. 進(jìn)行 LC-MS 分析前將制備好的 TMT-標(biāo)記樣品重懸于 0.1% TFA/5% ACN （v:v）溶劑中；重懸好的 TMT-標(biāo)記樣品能夠在 4 ℃ 穩(wěn)定保存一周，避免反復(fù)凍融。
為考察定量分析的準(zhǔn)確度，將 Thermo ScientificTM PierceTM HeLa 蛋白酶解產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)樣品（P/N 88328）按上述流程進(jìn)行標(biāo)記，將 TMTsixplex 通道 129–131 和 TMT10plex 通道 127N、127C 和 128N 分別以 10:10:10 比例混合，然后加入 E. coli 樣品中，每通道比例為 1:1（33 μg HeLa 酶解產(chǎn)物 + 67 μg E. coli 酶解產(chǎn)物）。

液相色譜
色譜分離條件設(shè)置詳見表 1。進(jìn)樣量相當(dāng)于 1 μg 起始蛋白質(zhì)。

質(zhì)譜儀
通過液相色譜洗脫得到的肽段分別由 Q Exactive Plus 和 Q Exactive HF 質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下進(jìn)行分析。儀器參數(shù)設(shè)置參見表 2。

 

表 3. 未標(biāo)記樣品的 LC 梯度。

時(shí)間	時(shí)長(zhǎng)	流速	%B
0	N/A	300	2
5	5	300	2
105	100	300	20
125	20	300	32
126	1	300	95
134	8	300	95

 

表 4. TMT 標(biāo)記樣品的 LC 梯度。

 

時(shí)間	時(shí)長(zhǎng)	流速	%B
0	N/A	300	5
3	3	300	5
5	2	300	7
105	100	300	25
125	20	300	60
126	1	300	95
134	8	300	95

 

隨著樣品復(fù)雜度增加，洗脫梯度也應(yīng)相應(yīng)地加長(zhǎng)（e.g.，4 小時(shí)）以保證更好的色譜分離。然而加長(zhǎng)洗脫梯度又不可避免地會(huì)導(dǎo)致色譜峰變寬以及母離子 S/N 降低。因此應(yīng)當(dāng)考慮增加進(jìn)樣量或是提高最大注入時(shí)間的限制。最終用于評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)效果的指標(biāo)應(yīng)當(dāng)是可定量肽段的數(shù)量，而所謂可定量肽段是指碎片譜圖包含所有預(yù)測(cè)報(bào)告離子峰的那些肽段。如圖 14 A 中所示，對(duì)于 1 μg 進(jìn)樣量，將洗脫梯度的時(shí)間從 2 小時(shí)增加到 4 小時(shí)，鑒定出的肽段數(shù)量從 3,241 個(gè)增加到了 3,810 個(gè)。鑒定結(jié)果顯然受益于分離效果的改善，因?yàn)閷?duì)低豐度肽段的檢測(cè)靈敏度增加使得蛋白序列覆蓋率也相應(yīng)地提高了。另一方面，可定量肽段數(shù)并沒有增加，因?yàn)樽畲笞⑷霑r(shí)間設(shè)置與 2 小時(shí)的梯度相同（表 2）。如果在加長(zhǎng)洗脫梯度的同時(shí)將進(jìn)樣量增加到 2 μg，則增加了 400 多條可定量肽段，將肽段的可定量數(shù)/可鑒定數(shù)所占比例提高到了 85%。同樣地，可定量蛋白質(zhì)組數(shù)也隨著色譜梯度時(shí)間和進(jìn)樣量的共同增加而增加（圖 14B）。這一結(jié)果說明，對(duì)于高動(dòng)態(tài)范圍的樣品（20:1），實(shí)現(xiàn)色譜分離條件、進(jìn)樣量和最大注入時(shí)間的最佳匹配才能取得可靠的定量分析結(jié)果。

 

MS1 參數(shù)

TMT 標(biāo)記對(duì)于母離子來說是真正的同量異序標(biāo)簽，因此 MS1分辨能力的設(shè)置是與未標(biāo)記樣品完全相同的: 對(duì)于 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 來說，其分辨率分別為 70,000 和 120,000。這樣的設(shè)置足以在不顯著影響數(shù)據(jù)依賴掃描模式循環(huán)時(shí)間的前提下，分辨絕大部分共洗脫物質(zhì)。 推薦 AGC 目標(biāo)為 3e6，有利于提高全掃的動(dòng)態(tài)范圍。

 

MS2 分辨能力

MS2 分辨能力不夠會(huì)導(dǎo)致背景或雜質(zhì)離子信號(hào)與報(bào)告離子信號(hào)混為一談，影響對(duì) S/N 的評(píng)估。對(duì)于 TMTsixplex 標(biāo)記的樣品來說，分辨率設(shè)置為 30,000 能夠保證報(bào)告離子與相近報(bào)告離子的同位素峰實(shí)現(xiàn)基線分離。12

對(duì)于 TMT10plex 試劑來說，13C 和 15N 同位素異構(gòu)體的質(zhì)量差異僅為 6 mDa。圖 15 中顯示的是不同比例下經(jīng) 4 通道 （128N，128C，129N，129C）標(biāo)記的肽段的報(bào)告離子區(qū)域。30,000 的分辨率設(shè)置不足以區(qū)分 N 和 C 同位素異構(gòu)體。對(duì)于 TMT10plex 標(biāo)記的樣品，合適的 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS分辨率設(shè)置分別應(yīng)為 35,000 和 60,000。

 

 

圖 14. 分析 TMTsixplex 標(biāo)記的 E. coli 和 Hela 混合樣品時(shí)，增加進(jìn)樣量和梯度洗脫時(shí)間后可鑒定和可定量的 E. coli 源肽段和蛋白質(zhì)的數(shù)量。

 

 

圖 15. 分辨率設(shè)置分別為 30,000，35,000 和 60,000 時(shí)，TMT10plex 標(biāo)記肽段報(bào)告離子區(qū)域細(xì)節(jié)圖。請(qǐng)注意，在 30,000 分辨率下僅得到部分分離。

 

MS2 最大注入時(shí)間

MS2 最大注入時(shí)間需要根據(jù)進(jìn)樣量、樣品復(fù)雜程度和洗脫梯度進(jìn)行調(diào)整。通常來說，更長(zhǎng)的注入時(shí)間能夠積累更多的母離子，報(bào)告離子的強(qiáng)度會(huì)相應(yīng)增加，更有利于中低豐度肽段的鑒定和定量分析。如圖 16 所示，最大注入時(shí)間從 64 ms 增加到 100 ms 大大提高了可定量蛋白質(zhì)和肽段的數(shù)量，也相應(yīng)地實(shí)現(xiàn)了更高的定量分析率。

如前所述，更長(zhǎng)的洗脫梯度需要更長(zhǎng)的注入時(shí)間。另一方面，注入時(shí)間的增加不應(yīng)該顯著影響儀器的整體速度，尤其是在分析復(fù)雜樣品的時(shí)候。一個(gè)理想的方法是將可允許的最大注入時(shí)間設(shè)成與 FT 轉(zhuǎn)換檢測(cè)時(shí)間匹配，因?yàn)樵摃r(shí)間是與儀器分辨率設(shè)置直接相關(guān)的。對(duì)于 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 來說，128 ms 的 Orbitrap 分析器檢測(cè)時(shí)間對(duì)應(yīng)的分辨率分別是 35,000 和 60,000，因此使用 100 ms 的注入時(shí)間與檢測(cè)時(shí)間非常匹配，能夠保證離子注入與 Orbitrap 檢測(cè)的高效并行。如圖 17 所示，增加注入時(shí)間同樣有利于提升定量檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

 

 

圖 16. 使用不同儀器設(shè)置時(shí)，純 E. coli 樣品中可鑒定和可定量肽段和蛋白質(zhì)組的數(shù)量。*方法設(shè)置詳情參見表 5。

 

表 5. 圖 16 中比較的每個(gè)方法的詳細(xì)參數(shù)。

	MS2 IT	MS2 AGC	MS2 NCE
Method 1	64 ms	5e4	30
Method 2	100 ms	5e4	30
Method 3	100 ms	1e5	30
Method 4	100 ms	1e5	32

 

圖 17. TMT-標(biāo)記的純 E. coli 中的比值。預(yù)期比例用虛線表示。請(qǐng)注意對(duì)于 128/126 和 129/126 比例，方法 4 的定量分析準(zhǔn)確度最高。

 

MS2 自動(dòng)增益目標(biāo)值（AGC）

自動(dòng)增益目標(biāo)值是需要設(shè)置的另一個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，其大小決定了 C trap 能積累并進(jìn)入 Orbitrap 分析器中進(jìn)行檢測(cè)的最大離子數(shù)。雖然 S/N 和鑒定效率會(huì)隨著離子數(shù)增加而增加，但偏高的 AGC 目標(biāo)值設(shè)置會(huì)造成離子聚集或其他與空間電荷相關(guān)的問題。13 圖 16 和 17 中比較了當(dāng)進(jìn)樣量為 1 μg 時(shí)，AGC 目標(biāo)值設(shè)置成 5e4 和 1e5 的定量結(jié)果差異。當(dāng)該參數(shù)設(shè)置為 1e5 時(shí)，能夠在獲得更多可定量肽段的基礎(chǔ)上，達(dá)到更好的定量準(zhǔn)度和精度，而并未引起離子聚集現(xiàn)象。

MS2 碰撞能量

 

NCE 是一個(gè)無量綱數(shù)值，大致相當(dāng)于質(zhì)量數(shù)為 500、電荷數(shù)為 1 的參比離子的碰撞能（單位 eV）。實(shí)際使用的能量是根據(jù)所選母離子的質(zhì)量和電荷數(shù)實(shí)時(shí)自動(dòng)計(jì)算的。常用的 NCE 設(shè)置（e.g.，NCE 27–28）能夠?yàn)殡亩舞b定生成足夠的碎片離子，不過事實(shí)證明它還不夠使 TMT 報(bào)告離子解離并實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量。然而碰撞能過大又會(huì)導(dǎo)致肽段過度碎裂，降低鑒定效率。14 通過研究發(fā)現(xiàn)，將碰撞能量從 NCE 30 提高至 NCE 32 能顯著提高可定量蛋白質(zhì)數(shù)而不會(huì)給鑒定效率帶來負(fù)面影響（圖 16）。 此外，高碰撞能還提高了定量分析的準(zhǔn)確度（圖 17）。因此，我們建議對(duì) TMT-標(biāo)記的樣品使用比未標(biāo)記樣品高 4-6 NCE 的碰撞能。

 

MS2 隔離窗口
Q Exactive 類型的儀器通常建議使用 2 Th 的隔離窗口，能夠保證足夠的離子傳輸和靈敏度。然而，擴(kuò)大隔離窗口會(huì)使干擾離子與母離子一并被隔離出來，降低了報(bào)告離子的定量分析準(zhǔn)確性。

此外，干擾離子的碎片還有可能污染 MS2 譜圖并導(dǎo)致鑒定得分降低。Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 都配備了 AQT，使得其在非常窄的隔離窗口設(shè)置下也能實(shí)現(xiàn)有效離子傳輸。我們分別在 0.7 和 1.2 Th 的隔離窗口設(shè)置下對(duì) E. coli 樣品進(jìn)行分析，其鑒定和定量結(jié)果非常接近（圖 18）。

 

圖 18. 不同隔離窗口設(shè)置下的可鑒定和可定量肽段組數(shù)。顯示數(shù)據(jù)是 E. coli 樣品進(jìn)行兩次平行分析的綜合結(jié)果。

 

為了評(píng)估適用于復(fù)雜樣品的隔離窗口，將純 E.coli 樣品（127C:128N:128C:129N:129C:130N 按 20:10:1:1:10:20 比例混合）與等量 HeLa 酶解樣品 （通道 127N，127C 和 128N 按 1:1:1 比例混合） 混合作為背景。結(jié)果顯示，受到 HeLa 酶解產(chǎn)物干擾影響的 E.coli 通道 127C 和 128N，其定量比值較理論值和其他無干擾的通道有明顯偏差（圖 19）。采用更窄的隔離窗口 （0.7 Th）可以減少共提取的干擾，定量精度略好于較寬窗口（1.2 Th）。對(duì)于高復(fù)雜度的樣品，我們建議使用 Orbitrap Fusion MS 和 Orbitrap Fusion Lumos MS 儀器中的 SPS MS3 方法來獲得高動(dòng)態(tài)范圍下的準(zhǔn)確定量分析。此外，可以借助樣品分級(jí)技術(shù)（e.g.，Thermo ScientificTM PierceTM 高 pH 反相肽段分離試劑盒，P/N 84868）來降低樣品復(fù)雜度。

 

理論上還可以采用更小的隔離窗口 （0.4 Th）來提高 Q Exactive Plus MS 或 Q Exactive HF MS 的定量分析精度，但是其定量靈敏度也會(huì)受到影響。

 

圖 19. 不同隔離窗口的定量分析精度，用可定量肽段組的定量比值中位數(shù)來表示。

 

總體來說，要在任何 Q Exactive 系列質(zhì)譜儀上進(jìn)行成功的 TMT 實(shí)驗(yàn)，都需要根據(jù)樣品特點(diǎn)仔細(xì)選擇相關(guān)參數(shù)。要達(dá)到高靈敏度和高精度的定量分析目標(biāo)，建議考慮以下因素：
1）采用更長(zhǎng)的洗脫梯度、更長(zhǎng)的柱子和更高上樣量。
2）為不同 TMT 標(biāo)簽調(diào)整 MS2 分辨率設(shè)置。
3）讓最大注入時(shí)間與分辨能力相匹配以實(shí)現(xiàn)最優(yōu)的質(zhì)譜工作循環(huán)。
4）根據(jù)標(biāo)簽數(shù)提高 AGC MS2 目標(biāo)，TMT10plex 最高可以設(shè)為 1e5。
5）在不會(huì)過度碎裂肽段的前提下提高 NCE 。
6）四極桿相對(duì)于傳統(tǒng)方法更窄的母離子隔離窗口，更適合鳥槍法（shortgun）測(cè)序的應(yīng)用。

 

結(jié)論

TMT 標(biāo)記能夠提高樣品分析通量并支持高達(dá)十個(gè)不同的生物樣品的相對(duì)定量，包括細(xì)胞、組織和體液。本研究用 TMTsixplex 和 TMT10plex 標(biāo)記的 E. coli 細(xì)胞裂解液樣品評(píng)估了 Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 儀器在蛋白質(zhì)/肽段鑒定效率和定量分析精度方面的性能。

Q Exactive Plus MS 和 Q Exactive HF MS 非常適合分析中低復(fù)雜度的樣品。而對(duì)于高復(fù)雜度樣品來說，最好能采用預(yù)分級(jí)的方式以提高定量分析精度和準(zhǔn)確度。通過比較并優(yōu)化多組不同參數(shù)設(shè)置，包括 MS2 分辨能力、最大注入時(shí)間、自動(dòng)增益目標(biāo)值和隔離窗口等，實(shí)現(xiàn)了最高的鑒定效率和最準(zhǔn)確的定量分析。同時(shí)，本文還詳細(xì)介紹了樣品前處理和液相色譜等相關(guān)設(shè)置，以及如何采用 Proteome Discoverer 軟件 2.1 版本進(jìn)行數(shù)據(jù)處理的方法和流程。

 

參考文獻(xiàn)
1. Schäfer, T. et al. Anal. Chem. 2003, 75(8), 1895.
2. Ross, P. et al. Mol Cell Proteomics 2004, 3(12), 1154.
3. Savitski, M. et al. Science 2014, 346(6205), 1255784.
4. Weekes, M. et al. Cell 2014, 157(6), 1460.
5. Rauniyar, N. et al. J Proteome Res. 2014, 13(12), 5293.
6. Christoforou, A. et al. Anal Bioanal Chem. 2012, 404(4), 1029.
7. Erickson, B. et al. Anal. Chem. 2015, 87(2), 1241.
8. Ting, L. et al. Nature Methods 2011, 8, 937.
9. Scheltema, R. et al. Mol Cell Proteomics 2014, 13(12), 3698.
10. McAlister, G. et al. Anal. Chem. 2012, 84(17),7469.
11. Thermo Scientific Proteome Discoverer 2.1 User Guide
12. Viner, R. et al. Thermo Fisher Scientific Application Note 566.
13. Werner, T. et al. Anal. Chem. 2014, 86(7), 3594.
14. Arrey, T. et al. Thermo Scientific Poster Note 64412.

 

  

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