束縛應(yīng)激所致小鼠腦區(qū)的神經(jīng)遞質(zhì)和行為改變及運(yùn)動干預(yù)效果

摘要：為了探討束縛應(yīng)激對小鼠神經(jīng)遞質(zhì)、行為的影響及有氧運(yùn)動的干預(yù)效果。選用 1 月齡 C57BL/6 小鼠 80 只，隨機(jī)分為 4 組：控制組(Control，n=20 只)、束縛應(yīng)激組(Stress，n=20 只)、運(yùn)動組(Ex，n=20 只)、運(yùn)動束縛應(yīng)激組(Stress+Ex，n=20 只)�？刂平M安靜飼養(yǎng)，束縛應(yīng)激組進(jìn)行2 周的束縛應(yīng)激，運(yùn)動組每天進(jìn)行 2 h 跑臺鍛煉，運(yùn)動束縛應(yīng)激組同時進(jìn)行束縛應(yīng)激和跑臺鍛煉。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：行為試驗(yàn)中，束縛應(yīng)激組小鼠社交行為顯著下降、焦慮及抑郁行為水平發(fā)生顯著上升(P<0.05)，而運(yùn)動干預(yù)能夠緩解束縛應(yīng)激對這些行為的影響。生化指標(biāo)同樣說明有氧鍛煉有效緩解了束縛應(yīng)激導(dǎo)致的行為和單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的改變。結(jié)果說明：束縛應(yīng)激會導(dǎo)致社交及情緒相關(guān)行為的改變，而運(yùn)動干預(yù)會起到有效的緩解作用。

關(guān)鍵詞：運(yùn)動生理學(xué)；束縛應(yīng)激；運(yùn)動；社交行為；單受神經(jīng)遞質(zhì)；小鼠

持續(xù)壓力會造成人或者動物改變社交習(xí)慣、降低認(rèn)知能力，甚至產(chǎn)生抑郁或者焦慮等情緒失調(diào)。因此，探索壓力應(yīng)激對個體腦及行為塑造作用機(jī)制對保障人類身心健康具有重要意義。束縛應(yīng)激是廣泛使用的模擬人類生活壓力應(yīng)激的動物模型之一。束縛應(yīng)激會影響動物的多種行為學(xué)和生物學(xué)指標(biāo)，其中包括對學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知方面的損害、社交互動行為的改變。急性束縛應(yīng)激會使機(jī)體產(chǎn)生負(fù)性情緒，造成腦部的海馬神經(jīng)元損傷，樹突棘和增生物增加。慢性束縛應(yīng)激因改變 HPA 軸的敏感性而造成行為的改變。大量研究發(fā)現(xiàn)，伴隨著大腦皮層、海馬及外周血中兒茶酚胺神經(jīng)遞質(zhì)及代謝物含量的改變，慢性束縛應(yīng)激會顯著降低實(shí)驗(yàn)動物的認(rèn)知功能。束縛應(yīng)激會造成神經(jīng)內(nèi)分泌改變，包括兒茶酚胺的降低及皮質(zhì)酮應(yīng)激反應(yīng)敏感性下降。這種神經(jīng)內(nèi)分泌的改變與神經(jīng)元中五羥色胺受體功能和表達(dá)的上升及五羥色胺神經(jīng)遞質(zhì)分泌的改變相關(guān)。慢性應(yīng)激會使杏仁核中的神經(jīng)元極度活躍，造成相對應(yīng)神經(jīng)元的損傷。而動物研究表明，運(yùn)動可調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)，如五羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)及它們的代謝產(chǎn)物，進(jìn)而會起到積極的干預(yù)作用。

雖然束縛應(yīng)激對神經(jīng)遞質(zhì)及行為影響的研究多見報(bào)道，但是運(yùn)動對慢性束縛應(yīng)激干預(yù)效應(yīng)和機(jī)制研究相對較少。因此，本研究用小鼠慢性束縛應(yīng)激模型考察運(yùn)動干預(yù)效果，探索其作用機(jī)制。

1  實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1  試劑與儀器

1)去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)購自美國 Sigma 公司，純度≥ 98.0％；乙腈：色譜純，采用美國 Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；高氯酸、碳酸氫鉀、冰醋酸等均為分析純，南京化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水為自制二次重蒸水。

2)LC.10AD vp 高效液相色譜儀、SPD-10AD vp 熒光檢測器、色譜柱為島津 Shim-pack  VP-ODS 的 CTs液相色譜柱(150  ibm×4.6  mm×5  μm)(日本島津公司)；GL.88B 旋渦混合器(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)；電恒溫水浴裝置(江蘇光都機(jī)電設(shè)備有限公司)；Supermaze動物行為分析系統(tǒng)、社交行為箱、高架十字迷宮、新物體識別箱、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)箱(上海欣軟公司)。

1.2  實(shí)驗(yàn)動物和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

C57BL/6 小鼠(3 周齡)購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。小鼠養(yǎng)在通風(fēng)的隔籠里，室溫為 20~25 ℃，相對濕度 60%  ，光暗周期為 12  h，保持安靜，食物和水按時提供。在正式實(shí)驗(yàn)前所有小鼠均預(yù)先適應(yīng) 1 周并且每天都進(jìn)行小鼠稱重。80 只小鼠隨機(jī)分成4 組，每組 20 只，控制組(n=20 只)，束縛應(yīng)激組(n=20只)，運(yùn)動組(n=20 只)，運(yùn)動束縛應(yīng)激組(n=20 只)。具體實(shí)施方案如下：適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周，束縛應(yīng)激為每天上午 10：00 開始持續(xù) 120 min，跑臺鍛煉時間為下午18:00 持續(xù) 30 min，每周訓(xùn)練 5 d，共 2 周。束縛應(yīng)激方法：取 50 m L 圓柱形離心管(管底留一個 3 mm 半徑小孔)，將小鼠放在只能容納小鼠整個軀體的管子中，將管子放在同一房間的不同籠子中，放置時間是上午09：00—11：00。跑臺鍛煉方法：進(jìn)行平坡的跑臺運(yùn)動，速度 0.8 km/h，坡度為 0°，實(shí)驗(yàn)開始前 1 天下午18：00 對小鼠進(jìn)行一次 15 min 的適應(yīng)性訓(xùn)練，然后第2 天按上述運(yùn)動方案訓(xùn)練。其中運(yùn)動束縛應(yīng)激組同時進(jìn)行束縛應(yīng)激和運(yùn)動干預(yù)；束縛應(yīng)激組只束縛應(yīng)激；運(yùn)動組只運(yùn)動干預(yù)；控制組與其它組小鼠一起飼養(yǎng)，無運(yùn)動干預(yù)和束縛應(yīng)激。所有動物實(shí)驗(yàn)均遵循東南大學(xué)倫理委員會指導(dǎo)文件操作。

1.3  指標(biāo)檢測

1 月齡小鼠正處于青少年期，為了研究是否束縛應(yīng)激會導(dǎo)致焦慮、抑郁以及社交行為的改變。在兩周實(shí)驗(yàn)完成后，依次進(jìn)行社交行為實(shí)驗(yàn)，高架十字迷宮、新奇-抑制攝食試驗(yàn)以及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證小鼠的焦慮和抑郁水平及運(yùn)動干預(yù)對小鼠這些行為的影響，行為實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，平衡 24 h 后處死并迅速檢測不同腦區(qū)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平。

1)社交行為實(shí)驗(yàn)。

社交行為實(shí)驗(yàn)采用包含有3個相同大小的房間(40 cm×40 cm×20 cm)的社交行為觀察室，中間為空房間并有通向兩側(cè)房間的通道，兩側(cè)房間分別各放 1 個鼠籠。實(shí)驗(yàn)小鼠分兩類，一類為社交行為專用陌生小鼠(stranger)，而另一類為實(shí)驗(yàn)鼠。測試選用 2 只社交行為專用陌生小鼠 1 和 2，均為雄性，年齡、體重相近，同實(shí)驗(yàn)小鼠品系相同且實(shí)驗(yàn)前沒有接觸過的小鼠。 用不透明的樹脂玻璃板隔離左右側(cè)兩個房間。實(shí)驗(yàn)開始前將實(shí)驗(yàn)鼠放入行為觀察箱的中間房間適應(yīng) 5 min，期間將陌生小鼠隨機(jī)放入一側(cè)房間的鼠籠中。實(shí)驗(yàn)小鼠可以同陌生小鼠隔著鼠籠相互嗅探，但無法進(jìn)行肢體接觸。正式實(shí)驗(yàn)開始時移去隔離板，通過動物行為分析系統(tǒng)分別記錄10 min內(nèi)實(shí)驗(yàn)小鼠同空鼠籠或陌生小鼠的互動時間和房間逗留時間�；�動時間=實(shí)驗(yàn)小鼠直接接觸鼠籠+距 2 cm 內(nèi)直立嗅探的時間。實(shí)驗(yàn)小鼠在每個房間的逗留時間以每只小鼠頭和四肢均進(jìn)入房間后為準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將實(shí)驗(yàn)小鼠取出、歸籠。每次實(shí)驗(yàn)后用體積分?jǐn)?shù)為 70%酒精清潔整個測試裝置以備下一個實(shí)驗(yàn)。具體過程見圖 1。

如圖 1 所示，籠中的為陌生小鼠，籠外的為實(shí)驗(yàn)小鼠，社交行為實(shí)驗(yàn)前后包括兩個階段：第 1 階段同時記錄(A)實(shí)驗(yàn)小鼠在陌生小鼠 1 或空鼠籠所在房間的逗留時間和(B)實(shí)驗(yàn)小鼠同空鼠籠或陌生小鼠 1 互動的時間；第 2 階段為(C)實(shí)驗(yàn)小鼠在陌生小鼠 1 或陌生小鼠 2 所在房間的逗留時間和(D)實(shí)驗(yàn)小鼠同陌生小鼠 1及陌生小鼠 2互動時間。

2)高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)。

將小鼠放在十字迷宮正中間，高度距離地面 1 m，兩邊為封閉臂，另兩邊為開放臂。用電子路徑系統(tǒng)記錄小鼠停留在開放臂和封閉臂的時間以及路徑。迷宮需用體積分?jǐn)?shù)為 70%的乙醇和水清洗、干燥無味后進(jìn)行下一只動物實(shí)驗(yàn)。

3)新奇-抑制攝食試驗(yàn)。

小鼠剝奪飲食一段時間后，分別放在新物體識別箱(60cm×60cm×30 cm)里。將1粒球狀鼠糧置于實(shí)驗(yàn)箱底的中心，每只小鼠放于實(shí)驗(yàn)箱底的角落，自由活動12min。記錄每只小鼠第1次吃到食物的時間，分別記錄測試結(jié)束后 30 min 內(nèi)每只小鼠在籠中的飲食情況。

4)強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)。

將小鼠放在水桶的中心(水溫 24~25  ℃；水桶半徑 20 cm，高 40 cm) 10 min。小鼠無法接觸水桶的底部。小鼠的行為通過視頻路徑監(jiān)控系統(tǒng)自動記錄。儀器自動記錄小鼠的潛在不動的時間及最后 4  min 的掙扎時間(四肢強(qiáng)烈掙扎、劃擦水桶壁)。

5)小鼠取材。

每只小鼠稱重后隨機(jī)分組，每周一下午 18：00鍛煉前，用電子天平(JZC-XXC，上海亞津科技有限公司)稱量各組小鼠體重。行為測試結(jié)束后靜置 24 h，斷頸椎處死，迅速剝離不同腦區(qū)并取血，腦組織樣品稱重，加入 50  μL 用冰預(yù)冷的 0.1  mol/L 高氯酸(含 10-7mol/L 維生素 C)用微量勻漿機(jī)勻漿，勻漿液再 5 200×g 離心(4℃) 30 min，然后用 0.22  μm 濾膜過濾并將 10 μL 濾液用 990  μL 蒸餾水稀釋到 1 m L，吸取 20  μL稀釋液注射到色譜儀進(jìn)行分析，其他樣品迅速置于-80℃保存。

6)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物檢測。

小鼠腦部的單胺神經(jīng)遞質(zhì)及其衍生物采用高效液相色譜熒光檢測法：采用 ESA MD-150 色譜柱(150 mm×3.2 mm，2.0 µm)，C18 預(yù)柱(10 mm×3 mm，3 µm)。激發(fā)波長為 345 nm，發(fā)射波長為 480 nm；流動相選擇：用 0.45  μm 的微孔濾膜過濾，超聲脫氣乙腈和 15 mmol/L 醋酸鹽緩沖液(p H4.7；35︰65，體積比)流速：1.0 m L/min，柱溫：30  ℃，進(jìn)樣量：20  μL。

7)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

所有數(shù)據(jù)均錄入 SPSS18.1 統(tǒng)計(jì)軟件，并通過方差分析統(tǒng)計(jì)束縛應(yīng)激以及運(yùn)動干預(yù)的作用。

3  討論

束縛應(yīng)激是模擬人類生活壓力改變?nèi)祟惿缃�、情緒及認(rèn)知等多種行為最常見的動物模型。同時，束縛應(yīng)激也是廣泛應(yīng)用的應(yīng)激障礙疾病動物模型，不但可以模擬免疫下降、認(rèn)知功能下降，還可以使小鼠產(chǎn)生焦慮及抑郁等癥狀。越來越多的證據(jù)說明，束縛應(yīng)激對腦具有塑造作用，這種塑造作用可以表現(xiàn)為基因、神經(jīng)內(nèi)分泌及行為學(xué)的改變。應(yīng)激將單胺類遞質(zhì)系統(tǒng)激活后，會對神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，因此重復(fù)應(yīng)激會使機(jī)體對應(yīng)激產(chǎn)生適應(yīng)。

在應(yīng)激狀態(tài)下，實(shí)驗(yàn)動物的腦內(nèi)可出現(xiàn) 5-HT 更新速率增加，使 HPA 軸過度亢進(jìn)或功能不足，進(jìn)而導(dǎo)致 5-HT 濃度改變。急性應(yīng)激使皮層、海馬，及杏仁核 5-HT 和其代謝產(chǎn)物 5-HIAA 的含量顯著增加；慢性應(yīng)激皮層 5HT 及 5-HIAA 逐漸恢復(fù)到或低于應(yīng)激前水平。大鼠在 3 h 急性運(yùn)動后或 8 周跑臺運(yùn)動后，大腦 5-HT 的水平都升高。微透析研究發(fā)現(xiàn)，60  min跑臺運(yùn)動后，大鼠海馬的 5-HT 水平升高。另外，研究表明，大鼠興奮水平與腦內(nèi) DA 釋放成正相關(guān)，重復(fù)應(yīng)激后動物海馬 DA 水平降低。運(yùn)動使大鼠前額皮質(zhì)、海馬和紋狀體的 DA 水平及其代謝物水平都有所增加。因此，之前的研究似乎表明海馬神經(jīng)元與情緒的興奮、抑制平衡有關(guān)系。

在本研究中，對應(yīng)激組被試小鼠不同腦區(qū)中單胺類遞質(zhì)檢測發(fā)現(xiàn)，5-HT、DA 及 NE 在大部分腦區(qū)中含量均有所降低，部分結(jié)果與之前的研究結(jié)果相一致，說明束縛應(yīng)激是易復(fù)制的應(yīng)激動物模型。第 1，本研究證明了束縛應(yīng)激可以使小鼠焦慮和抑郁行為增加；第 2，本研究的結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)束縛應(yīng)激降低了小鼠社交行為；最后，本研究發(fā)現(xiàn)束縛應(yīng)激使小鼠不同腦區(qū)大多數(shù)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平下降。總的來說，本研究結(jié)果與之前束縛應(yīng)激小鼠模型結(jié)果相一致，證明本束縛應(yīng)激模型成功復(fù)制模擬壓力影響個體行為傾向性的模型。

同時，本研究發(fā)現(xiàn)小鼠束縛應(yīng)激后會出現(xiàn)社交互動行為下降、焦慮及抑郁水平增加的情況。這些行為的改變可能與不同腦區(qū)抑制性與興奮性單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)相關(guān)。更重要的是，運(yùn)動干預(yù)可以緩解束縛應(yīng)激后的焦慮抑郁相關(guān)行為、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物水平的改變。這些結(jié)果說明周期為 2 周、每天 2 h 的慢性束縛應(yīng)激可能會使小鼠產(chǎn)生適度的焦慮抑郁行為，而運(yùn)動干預(yù)卻降低了束縛應(yīng)激產(chǎn)生的這種變化。

大量研究證明運(yùn)動可以用來緩解壓力造成的負(fù)性情緒及行為，提高認(rèn)知功能。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究用運(yùn)動干預(yù)的方法來緩解壓力造成的焦慮、抑郁及社交相關(guān)行為的改變。本研究結(jié)果說明運(yùn)動緩解了應(yīng)激造成的多種行為學(xué)及生物學(xué)的變化。部分結(jié)果與之前的相關(guān)研究結(jié)果不一致，有待進(jìn)一步深入研究。