提  綱

一、化療藥物的發(fā)展

二、腫瘤的藥物治療

三、抗腫瘤藥物篩選及評(píng)價(jià)

四、體外抗腫瘤活性試驗(yàn)

五、體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)

一、化療藥物的發(fā)展

• 近代腫瘤化療學(xué)始于20世紀(jì)40年代。

•  50年代通過(guò)動(dòng)物篩選化療藥物發(fā)現(xiàn)了5FU、MTX、CTX等，化療學(xué)有了發(fā)展。

•  60年代認(rèn)識(shí)到腫瘤細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及化療藥藥代動(dòng)力學(xué)的重要性。大部分目前所用的抗癌藥已發(fā)現(xiàn)，有急淋、HD、睪丸癌等可化療治愈。

•  70年代形成腫瘤內(nèi)科學(xué)，更多腫瘤有了比較成熟的化療方案。

•  80年代研究以生物反應(yīng)修飾劑等藥物來(lái)提高化療療效，探索抗藥性產(chǎn)生的原因，5%腫瘤患者可治愈。    

•  90年代新抗癌藥進(jìn)入臨床，多藥耐藥基因發(fā)現(xiàn)，生物治療，基因治療輔助治療改善等，療效進(jìn)一步提高。

二、腫瘤的藥物治療

1、細(xì)胞毒類(lèi)抗腫瘤藥

a、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑

原理： 

真核細(xì)胞DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ（Topo Ⅰ)是生物體內(nèi)及其重要的細(xì)胞核內(nèi)酶，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和修復(fù)等所有關(guān)鍵的核內(nèi)過(guò)程。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ已成為重要的抗腫瘤藥物研究新靶點(diǎn)。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑已成為高選擇性抗腫瘤藥物研究的一個(gè)主攻方向。

代表藥物：喜樹(shù)堿類(lèi)化合物

對(duì)S期的毒性作用，這一作用需共價(jià)TopoI－DNA復(fù)合物的形成和DNA復(fù)制。TopoI抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而非DNA斷裂是引起細(xì)胞最終死亡的原因。

b、胸苷酸合成酶抑制劑

原理： 

胸苷酸合成酶（TS）把單磷酸脫氧尿嘧啶（DUMP）轉(zhuǎn)換成單磷酸胸腺嘧啶（TMP），在DNA復(fù)制和細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。是已知抗腫瘤藥物的重要有效靶點(diǎn)之一。胸苷酸合成酶抑制劑導(dǎo)致了DNA斷裂從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

代表藥物：培美曲塞 

它是一種結(jié)構(gòu)上含有核心為吡咯嘧啶基團(tuán)的抗葉酸制劑，通過(guò)破壞細(xì)胞內(nèi)葉酸依賴(lài)性的正常代謝過(guò)程，抑制細(xì)胞復(fù)制，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。體外研究顯示，培美曲塞能夠抑制胸苷酸合成酶、二氫葉酸還原酶和甘氨酰核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶活性，這些酶都是合成葉酸所必需的酶。一旦培美曲塞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，它就在葉酰多谷氨合成酶的作用下轉(zhuǎn)化為多谷氨酸的形式。多谷氨酸存留于細(xì)胞內(nèi)成為胸苷酸合成酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑。多谷酸化在腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)時(shí)間-濃度性過(guò)程，而在正常組織內(nèi)濃度很底。多谷氨酸化代謝物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的半衰期延長(zhǎng)，從而也就延長(zhǎng)了藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的作用時(shí)間。

c、鉑類(lèi)抗腫瘤藥物

原理： 

鉑絡(luò)合物產(chǎn)生抗腫瘤活性的原因，是由于其與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合，從而干擾DNA的復(fù)制，抑制腫瘤細(xì)胞的分裂。

代表藥物：順鉑和奧沙利鉑

2、以細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物

a、蛋白酪氨激酶（PTK）抑制劑

原理： 

PTK是一組酶系，能催化ATP上的磷酸基轉(zhuǎn)移到許多重要的蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上，使其殘基磷酸化，從而激活各種底物酶，通過(guò)一系列反應(yīng)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化。

代表藥物：依馬替尼  

依馬替尼一種抑制Bcr-Abl酪氨酸激酶的蛋白酪氨酸激酶抑制劑，Bcr-Abl酪氨酸激酶是CML中由費(fèi)城異常染色體引起的異常酪氨酸激酶。它能抑制Bcr-Abl陽(yáng)性細(xì)胞系和費(fèi)城染色體陽(yáng)性CML新鮮白血病細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

b、表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑

原理：通過(guò)擴(kuò)散進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，與 EGFR 的胞內(nèi)段激酶結(jié)合區(qū)結(jié)合，從而抑制 EGFR 受體的磷酸化，阻斷受體下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)，發(fā)揮抗腫瘤作用。

代表藥物：吉非替尼  

研究表明吉非替尼的作用通過(guò)上調(diào) P27KIP1和 P21CIP/WAF1 的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞 G1 期阻滯或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

C、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑

原理：

法尼基轉(zhuǎn)移酶是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的與Ras蛋白異戊二烯化修飾密切相關(guān)的一種必需酶。抑制法尼基轉(zhuǎn)移酶活性，阻止Ras蛋白的活化，可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖

代表藥物：替匹法尼

3、腫瘤新生血管生成抑制藥物

原理：

原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是依賴(lài)于新生血管生成的，開(kāi)發(fā)和研究能夠破壞或抑制血管生成、有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的藥物（稱(chēng)為T(mén)A 抑制劑），是新型抗腫瘤藥物研究的活躍領(lǐng)域之一。

代表藥物：angiostatin和endostatin

Avastin Endostatin可直接與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增生；可與肝素樣的硫酸蛋白結(jié)合，抑制血管生成；可抑制VEGF等血管生長(zhǎng)因子，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與腫瘤的生長(zhǎng)；可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x1,促使血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡加速。

4、腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑

原理：

根據(jù)腫瘤耐藥的特點(diǎn)可分為原藥耐藥(PDR)和多藥耐藥(MDR)兩大類(lèi)。前者只對(duì)誘導(dǎo)藥物產(chǎn)生耐藥性而對(duì)其它藥物不產(chǎn)生交叉耐藥性，如抗代謝藥甲氨蝶呤(MTX)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)等；后者則是指腫瘤細(xì)胞一旦對(duì)某種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)對(duì)其它結(jié)構(gòu)上無(wú)關(guān)、作用機(jī)制各異的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性，這是一種獨(dú)特的廣譜耐藥現(xiàn)象。許多天然來(lái)源的抗腫瘤藥物如秋水仙堿、紫杉醇等及蒽環(huán)類(lèi)抗癌抗生素如阿霉素、柔紅霉素都極易發(fā)生MDR。

腫瘤耐藥產(chǎn)生的可能原因是藥物代謝障礙、DNA修復(fù)機(jī)制障礙、DNA多聚酶活性改變等。另外，耐藥是凋亡抑制的表現(xiàn)。一些與凋亡抑制相關(guān)的癌基因(如bcl-2,bcr/abl,NF/KB等)的表達(dá)產(chǎn)物可阻斷或阻礙多種因素(如化療藥物、輻射、激素等)誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生耐藥性。 研究表明MDR的產(chǎn)生是由于細(xì)胞內(nèi)藥物積聚發(fā)生障礙，此后研究證實(shí)細(xì)胞內(nèi)藥物積聚降低的同時(shí)，有一分子量約為170 000細(xì)胞膜蛋白過(guò)度表達(dá)，稱(chēng)之為P-糖蛋白(Pgp)

代表藥物：鈣拮抗藥（維拉帕米及其衍生物）、鈣調(diào)蛋白拮抗藥（包括氯丙嗪等吩噻嗪類(lèi)衍生物）、環(huán)孢素類(lèi)（環(huán)孢素及其衍生物PSC833，SDZ280-466等）及抗雌激素類(lèi)化合物（他莫昔芬）等。

5、分化誘導(dǎo)劑

原理：

通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡達(dá)到腫瘤縮小、消退的目的已成為當(dāng)今腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。促進(jìn)惡性細(xì)胞向成熟分化的抗癌藥物稱(chēng)分化誘導(dǎo)劑。

代表藥物：維A酸類(lèi)化合物

咪唑衍生物利阿唑

 維A酸類(lèi)化合物維甲酸類(lèi)化合物(Retinoic acids)在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等生命活動(dòng)中起重要作用。其在體內(nèi)的生理活性代謝產(chǎn)物包括全反式維甲酸(ATRA)、13-順維甲酸(13-cis-RA)和9-順維甲酸(9-cis-RA)，它們可通過(guò)核維甲酸受體(RAR)結(jié)合于DNA應(yīng)答元件，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。

6、基因調(diào)節(jié)藥物

a、反義藥物

反義藥物又稱(chēng)反義寡核苷酸藥物（AODNs） ，是指人工合成長(zhǎng)度為10～30個(gè)堿 基的DNA分子及其類(lèi)似物。根據(jù)核苷酸雜交原理，反義藥物能與特定的 基因雜交，在基因水平上干擾致病蛋白質(zhì)的產(chǎn)生過(guò)程。 AODNs 可以與其靶RNA鏈互補(bǔ)結(jié)合，形成RNA-DNA雜交雙鏈。形成的雜交雙鏈可以被RNA酶H識(shí)別并消化RNA鏈，由此釋放出的 AODN可以繼續(xù)與靶RNA鏈結(jié)合，最終導(dǎo)致編碼基因沉默。由此可推RNA酶H過(guò)多表達(dá)可增強(qiáng)各種AODNs效應(yīng)，反之RNA酶H受抑則降低其作用。有些AODNs 并不能激活RNA酶H，相反與翻譯元件競(jìng)爭(zhēng)空間因此可抑制RNA翻譯。另外，AODNs 如果和mRNA結(jié)合可作用于內(nèi)含子外顯子接合處以中斷其拼接過(guò)程。AODNs還可以占領(lǐng)校正RNA細(xì)胞內(nèi)定位的蛋白－RNA作用序列，從而擾亂RNA運(yùn)輸，

藥物：Vitravene

b、Decoy核酸

Decoy核酸是與靶轉(zhuǎn)錄因子具有高親和性的雙鏈寡聚核酸 ,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制轉(zhuǎn)錄因子與調(diào)控區(qū)域的結(jié)合 ,調(diào)控轉(zhuǎn)錄來(lái)改變下游基因的異常表達(dá) ,從而抑制腫瘤惡性增殖 .

體外篩選結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子AP2的decoy核酸藥物 ,結(jié)果OG03對(duì)多種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著的抑制作用 ,在異植人腫瘤細(xì)胞NCI-H460的裸鼠模型中 ,靜脈注射高中低三劑量組的decoy核酸OG03 ,抑瘤率分別達(dá) 71.8%、64.4 %及 57.3%.通過(guò)凝膠阻抑試驗(yàn) ,驗(yàn)證了OG03與轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生特異性結(jié)合 .實(shí)驗(yàn)結(jié)果為decoy核酸轉(zhuǎn)錄調(diào)控藥物的研究提供了依據(jù)。

C、RNA干擾

RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是由雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因靜默機(jī)制. RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因表達(dá)的監(jiān)控機(jī)制。由于RNA干擾是針對(duì)轉(zhuǎn)錄后階段的基因沉默，相對(duì)于傳統(tǒng)基因治療對(duì)基因水平上的敲除，整個(gè)流程設(shè)計(jì)更簡(jiǎn)便，且作用迅速，效果明顯，為基因治療開(kāi)辟了新的途徑。其總體思路是通過(guò)加強(qiáng)關(guān)鍵基因的RNAi機(jī)制，控制疾病中出現(xiàn)異常的蛋白合成進(jìn)程或外源致病核酸的復(fù)制及表達(dá)。

7、單克隆抗體藥物  

單克隆抗體(單抗)藥物就是通過(guò)淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)或基因工程技術(shù)制備的抗體。起初用于診斷劑或檢測(cè)劑，后來(lái)用于治療腫瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾病。治療腫瘤的優(yōu)越性：

         （1）單抗藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用　

         （2）單抗藥物具有更高的療效

         （3）單抗藥物對(duì)腫瘤相關(guān)靶點(diǎn)的特異性作用

其研究重點(diǎn)主要集中在將抗體與化學(xué)藥物、酶、放射性核素、毒素和生物誘導(dǎo)劑等耦聯(lián)后直接殺傷腫瘤或者利用抗體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成等方面。目前，國(guó)際上與腫瘤治療相關(guān)的抗體研究主要集中在將抗體與耦聯(lián)物作用后直接殺傷腫瘤細(xì)胞，利用抗體促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤血管生成等方面。

代表藥物：曲妥珠單抗（trastuzumab， Herceptin ）

      Trastuzumab為靶向結(jié)合HER2的人IgG1類(lèi)單抗，HER2為酪氨酸激酶受體，在約20%～25%的進(jìn)展期乳腺癌患者過(guò)表達(dá)。HER2分子具有以下的特點(diǎn)，因此成為乳腺癌治療的靶分子：

    ①HER2的表達(dá)水平與乳腺癌的發(fā)病機(jī)理及預(yù)后相關(guān)；

    ②腫瘤的HER2表達(dá)水平及基因拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于正常組織，有效的減輕了HER2靶向治療藥物的毒性；

    ③HER2表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞比例很高，而且在腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，因此在患者體內(nèi)可以靶向大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞；

    ④HER2在原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移灶均有表達(dá)，因此HER2靶向治療對(duì)原發(fā)及轉(zhuǎn)移病灶均有效。

曲妥珠單抗（trastuzumab）的作用機(jī)制：

①抑制受體信號(hào)傳導(dǎo)。HER2可以活化多種信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括PI3K、MAPK等。Trastuzumab減少了這些信號(hào)通路的傳導(dǎo)，將細(xì)胞阻滯于調(diào)定點(diǎn)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。受體信號(hào)傳導(dǎo)的降低是由于trastuzumab介導(dǎo)的HER2受體內(nèi)化及降解。

②通過(guò)調(diào)節(jié)p27kipl阻滯細(xì)胞于G1調(diào)定點(diǎn)。Trastuzumab處理的細(xì)胞被阻滯于G1調(diào)定點(diǎn)，細(xì)胞增殖減少。細(xì)胞阻滯于G1調(diào)定點(diǎn)與細(xì)胞周期依賴(lài)的激酶抑制蛋白p27kipl相關(guān)。

③誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)研究表明trastuzumab可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡，凋亡的發(fā)生與Ki67的表達(dá)無(wú)關(guān)。

④抑制血管形成。高表達(dá)HER2的腫瘤細(xì)胞新生血管及VEGF的表達(dá)顯著增加。體內(nèi)研究結(jié)果顯示trastuzumab處理后，乳腺癌腫瘤體積減小，微血管密度降低；體外研究表明trastuzumab處理后，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力下降。

⑤ 抑制DNA修復(fù)。體外研究顯示可與許多化療藥物產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。Trastuzumab或聯(lián)合化療藥物促進(jìn)DNA損傷，并抑制DNA的修復(fù)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

三、抗腫瘤藥物篩選及評(píng)價(jià)

 以國(guó)立腫瘤研究所（Nationai Cancel Institute  NCI)為代表的美國(guó)抗腫瘤藥物篩選模式經(jīng)歷了三個(gè)發(fā)展階段。

•  1955-1985年，以動(dòng)物移植性腫瘤為基本模型，以動(dòng)物生命延長(zhǎng)率和瘤重抑制率為藥物活性的基本評(píng)價(jià)指標(biāo)，此階段是以化合物為本位的體內(nèi)篩選方法。

•  1985-1990年，NCI提出并在廣泛研究和試點(diǎn)的基礎(chǔ)上逐漸完善以人腫瘤細(xì)胞株為基礎(chǔ)、疾病本位的體外抗腫瘤藥物篩選模型。這階段是新舊篩選模型并存，新的篩選體系逐漸取代舊篩選體系的過(guò)渡階段。

•  1990-至今，以人腫瘤細(xì)胞株為基礎(chǔ)、疾病本位的體外抗腫瘤藥物篩選體系，其目的在于發(fā)現(xiàn)對(duì)某種組織類(lèi)型腫瘤活性強(qiáng)但可能對(duì)其他組織類(lèi)型腫瘤活性弱的化合物。在該體系中，樣品先經(jīng)過(guò)9大類(lèi)60種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行體外篩選，結(jié)果通過(guò)評(píng)估后，再進(jìn)行裸鼠體內(nèi)的人類(lèi)腫瘤異種移植研究。

    國(guó)內(nèi)抗腫瘤藥物篩選和研究體系雖與NCI相似，但也形成了自己的特點(diǎn)。

❶根據(jù)我國(guó)腫瘤發(fā)病情況，選擇試驗(yàn)瘤株組成，主要選擇白血病、肺癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等細(xì)胞株，相當(dāng)一部分是細(xì)胞株是國(guó)內(nèi)自己建的。

❷體外抗瘤譜試驗(yàn)選用了正常細(xì)胞株，綜合考慮了受試樣品對(duì)正常組織的毒性。

❸選用了人腫瘤耐藥細(xì)胞株，測(cè)試受試樣品的耐藥逆轉(zhuǎn)作用和耐藥細(xì)胞株增殖的直接抑制作用，以期發(fā)現(xiàn)具有抗耐藥作用的藥物。

❹選用人血管內(nèi)皮細(xì)胞株進(jìn)行同步體外試驗(yàn)，初步考察受試樣品是否具有血管生成抑制作用。

抗腫瘤藥的臨床前藥理研究包括藥效學(xué)和毒性研究兩部分

抗腫瘤藥物藥效學(xué)需研究?jī)?nèi)容：

體外抗腫瘤試驗(yàn)、體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)

評(píng)價(jià)藥物的抗癌活性時(shí)，以體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為主，同時(shí)參考體外試驗(yàn)結(jié)果以做出正確的結(jié)論。 

四、體外抗腫瘤活性試驗(yàn)

目的：

❶對(duì)候選化合物進(jìn)行初步篩選； 

❷了解候選化合物的抗瘤譜；

❸為隨后進(jìn)行的體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)提供參考，如劑量范圍、腫瘤類(lèi)別等 。 

體外試驗(yàn)常用方法有：

1、染料排斥法

試驗(yàn)原理：活細(xì)胞有排斥某些染料如伊紅、臺(tái)盼藍(lán)、苯胺黑等的能力，而死細(xì)胞由于膜完整性的破壞，可被著色。因此培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中加入這些染料，一定時(shí)間后，對(duì)著色和未著色的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，即可算出被殺死的細(xì)胞比例。

方法要點(diǎn)：向一定容積的待檢細(xì)胞懸液加入定量的某種染液，最常用的是0.4%臺(tái)盼藍(lán)液，混勻，室溫染色5-15min，將已染色的細(xì)胞懸液滴加至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，直接在光鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)。

觀測(cè)指標(biāo)：按（未染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）X100%計(jì)算活細(xì)胞率，對(duì)照組活細(xì)胞率應(yīng)在90%以上。根據(jù)活細(xì)胞率計(jì)算受試樣品的半數(shù)致死劑量（IC50）作為藥物抗腫瘤活性的指標(biāo)。

2、四氮唑鹽還原法

試驗(yàn)原理：四氮唑[MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide]是一種能接受氫原子的染料。活細(xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶在細(xì)胞內(nèi)可將黃色的MTT轉(zhuǎn)化成不溶性的藍(lán)紫色的甲[月替] (formazan)，而死的細(xì)胞則無(wú)此功能。用二甲基亞諷(DMSO)溶解甲[月替]后，在一定波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度值，即可定量測(cè)出細(xì)胞的存活率。 

方法要點(diǎn)：受試樣品處理細(xì)胞結(jié)束后，加入5mg/ml MTT液20微升/孔，繼續(xù)培養(yǎng)四小時(shí)。再加三聯(lián)液并培養(yǎng)過(guò)夜。在酶標(biāo)儀上于570nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。

 觀測(cè)指標(biāo)  直接指標(biāo)為96孔板上各被測(cè)孔的OD值；然后按公式（對(duì)照組OD值-治療組OD值）/對(duì)照組OD值×100%計(jì)算出相應(yīng)的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率；劇情況可進(jìn)一步采用Logit法計(jì)算50%生長(zhǎng)抑制濃度IC50值。 

3、阿拉馬藍(lán)法

試驗(yàn)原理：非熒光性藍(lán)色底物阿拉馬藍(lán)可被活細(xì)胞中的線粒體內(nèi)的NADPH相關(guān)的脫氫酶類(lèi)還原為強(qiáng)熒光性粉紅色底物，采用微培養(yǎng)板自動(dòng)讀數(shù)儀在激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)分別為530nm和590nm處讀取熒光強(qiáng)度值，與活細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

方法要點(diǎn)：細(xì)胞經(jīng)受試樣品處理后，加入10-20ul阿拉馬藍(lán)染液，繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間，用微培養(yǎng)板自動(dòng)讀數(shù)儀在激發(fā)與發(fā)射波長(zhǎng)分別為530nm和590nm處讀取熒光強(qiáng)度值。

觀測(cè)指標(biāo)：根據(jù)熒光強(qiáng)度可以計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，適當(dāng)時(shí)可進(jìn)一步計(jì)算IC50值。

4、磺酰羅丹明染色法 

試驗(yàn)原理：SRB是一種蛋白質(zhì)結(jié)合染料，粉紅色，可溶于水。 SRB可與生物大分子中的堿性氨基酸結(jié)合。其在515 nm波長(zhǎng)的OD讀數(shù)與細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。故可用作細(xì)胞數(shù)的定量。MTT法的一個(gè)缺點(diǎn)是OD值可隨放置時(shí)間而變，而SRB法無(wú)此現(xiàn)象。因此更適用于進(jìn)行大規(guī)模的試驗(yàn)。 

方法要點(diǎn)： 用10%冷三氯乙酸與4℃固定已經(jīng)受試樣品處理的細(xì)胞1h，洗滌，干燥；加入4mg/ml SRB液100微升/孔 染色15min，1%冰醋酸洗滌，干燥；最后加入150微升/孔 的Tris溶液，在酶標(biāo)儀上與515nm波長(zhǎng)處檢測(cè)OD值。

觀測(cè)指標(biāo)  同MTT法。另外，NCI目前采用以下指標(biāo)評(píng)價(jià)化合物的體外抗腫瘤活性。測(cè)定的OD值包括對(duì)照組、加藥組及加藥時(shí)的細(xì)胞的OD值C、T、和T0。據(jù)此計(jì)算：

       生長(zhǎng)抑制率（%）=（T－T0）/（C—T0）×100% ；細(xì)胞死亡率（%）=（T—T0）/  T0 ×100% 。

       按生長(zhǎng)抑制率或細(xì)胞死亡率對(duì)樣品濃度繪出量效關(guān)系曲線圖，并求出：

        GI50，即生長(zhǎng)抑制率為50%時(shí)的樣品濃度；

        TGI，即生長(zhǎng)抑制率為100%時(shí)的樣品濃度：

        LC50，即細(xì)胞死亡率為50%時(shí)的樣品濃度。

5、集落形成法

試驗(yàn)原理：克隆原細(xì)胞具有持續(xù)增殖能力，當(dāng)單個(gè)細(xì)胞分裂6代或6代以上時(shí)，其后代所組成的群體(集落)便含50個(gè)以上細(xì)胞。通過(guò)集落計(jì)數(shù)可對(duì)克隆原細(xì)胞作定量分析。它反映了單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力，故能較靈敏地測(cè)定抗癌藥的活性，日前被認(rèn)為是一種較理想的檢測(cè)方法。

方法要點(diǎn)：將濃度為500個(gè)細(xì)胞/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液2ml種至35ml的培養(yǎng)皿，并加受試樣品適量，培養(yǎng)7d或更長(zhǎng)時(shí)間，姬姆薩染色，解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)含50細(xì)胞以上的集落。

觀測(cè)指標(biāo)：根據(jù)集落數(shù)計(jì)算集落形成率，對(duì)照組集落形成率不應(yīng)低于40%，再計(jì)算用藥組的集落形成抑制率，根據(jù)情況可進(jìn)一步采用Logit法計(jì)算受試樣品的IC50值。

     集落形成率=集落數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)X100%

     集落形成抑制率=（1-用藥組集落形成率）/對(duì)照組集落形成率X100%

6、生長(zhǎng)曲線測(cè)定法

試驗(yàn)原理：在最適條件下，腫瘤細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈指數(shù)生長(zhǎng)，如取細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)與培養(yǎng)時(shí)間作圖可得一條直線，故稱(chēng)此時(shí)為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。隨著細(xì)胞密度不斷增高，由于代謝產(chǎn)物的積聚及營(yíng)養(yǎng)物的消耗，細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸減慢以致停止，此時(shí)稱(chēng)高坪期或穩(wěn)定期。因此藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響可通過(guò)生長(zhǎng)曲線反映出來(lái) 。

方法要點(diǎn)： 將濃度為10000個(gè)細(xì)胞/ml的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液按每瓶5ml種至25ml的培養(yǎng)瓶，或按每孔100微升種至96孔板，并加受試樣品適量，培養(yǎng)后分別于即刻和1、2、3、4、5、6、7d進(jìn)行檢測(cè)。前者可采用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)活細(xì)胞，后者可采用MTT法或SRB法讀取OD值，并據(jù)此進(jìn)行作圖與計(jì)算。 

 觀測(cè)指標(biāo)  1、倍增時(shí)間(TD),將實(shí)際生在曲線進(jìn)行直線回歸求出0和t時(shí)刻的理論細(xì)胞數(shù)N0和N t，據(jù)此計(jì)算：TD=0.301t/（log N t—log N0）；2 增殖細(xì)胞殺傷率（%）=( N0—N0’)/ N0×100%；3 細(xì)胞生長(zhǎng)飽和密度（N s），代表高坪期每毫升細(xì)胞數(shù)的均數(shù)。 

藥物與細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)間一般為48-72 小時(shí)，貼壁細(xì)胞需先貼壁24 小時(shí)后再給藥。試驗(yàn)應(yīng)設(shè)陽(yáng)性及陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照用一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥，陰性對(duì)照為溶媒對(duì)照 

a、體外篩選方法的優(yōu)點(diǎn)：

❶操作簡(jiǎn)單；

❷用藥量少；

❸取材可直接用于人體腫瘤；

❹得出結(jié)果快速；

b、體外篩選方法的缺陷：

❶細(xì)胞毒性易顯陽(yáng)性，有毒物質(zhì)也常常顯陽(yáng)性，故假陽(yáng)性率高；

❷非直接對(duì)腫瘤細(xì)胞作用的藥物顯示假陰性；

❸體外細(xì)胞并不能完全代表體內(nèi)腫瘤的惡性細(xì)胞；

五、體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)

1、自發(fā)性腫瘤

2、誘發(fā)的腫瘤

3、移植性腫瘤

（a）皮下腫瘤模型 

選擇腫瘤生長(zhǎng)旺盛且無(wú)潰破的荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，在無(wú)菌條件下（超凈臺(tái)或接種罩），用碘酒、酒精或新潔爾滅消毒動(dòng)物皮膚，切開(kāi)皮膚，剝離腫瘤。將瘤組織剪成1.5 mm3左右，用套管針接種于動(dòng)物一側(cè)或雙側(cè)腋窩皮下；或制成細(xì)胞懸液，然后按一定比例加入無(wú)菌生理鹽水，一般每只小鼠接種腫瘤細(xì)胞數(shù)量為（1-5）×106。

  

（b）腹水瘤模型 

無(wú)菌條件下，消毒動(dòng)物皮膚，吸取生長(zhǎng)良好的動(dòng)物腹水，以生理鹽水按一定比例稀釋后接種于動(dòng)物腹腔，接種細(xì)胞數(shù)量一般為（1-5）×106。

（c）原位接種模型 

原位接種是指將來(lái)源于某臟器的腫瘤接種在動(dòng)物的某臟器，如將人肝癌接種在裸小鼠的肝臟。原位接種不是常規(guī)的方法，但有其優(yōu)越性，是鼓勵(lì)使用的方法。主要有肺、肝、胃、腸、乳腺、顱內(nèi)等原位接種方法。 

小鼠腫瘤模型 淋巴細(xì)胞白血病腹水瘤L1210和P388、白血病L-615、宮頸癌U14、肝癌H22、Lewis肺癌、黑色素瘤B16、網(wǎng)織細(xì)胞瘤M5076、腸癌26、腸腺癌38、乳腺癌CD8F1、艾氏腹水瘤（EAC）、肉瘤-180等，以及各種小鼠腫瘤的亞型和耐藥株等。

人癌裸小鼠移植瘤模型 應(yīng)選用體外試驗(yàn)敏感細(xì)胞株進(jìn)行體內(nèi)抗人癌裸小鼠移植瘤試驗(yàn)。

 模型建立和使用應(yīng)注意：

❶移植瘤一般由相應(yīng)的細(xì)胞株移植而建立，對(duì)細(xì)胞株和移植瘤的化療敏感性應(yīng)予了解；

❷ 移植瘤復(fù)蘇后一般應(yīng)傳2-3代后再用于體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)；

❸ 對(duì)模型生長(zhǎng)情況應(yīng)全面了解，尤其是生長(zhǎng)快的模型；

❹ 為了保持移植瘤的生物學(xué)特性和遺傳特性，復(fù)蘇后移植瘤體內(nèi)傳代應(yīng)少于 15-20代 ；

給藥方案和給藥途徑

分組當(dāng)日開(kāi)始給藥，根據(jù)不同藥物的代謝動(dòng)力學(xué)和毒性反應(yīng)等確定給藥方案。給藥途徑應(yīng)與推薦臨床用藥的途徑相同。 給藥次數(shù)較多，或被試物質(zhì)溶解性較差，靜脈給藥有困難時(shí)，可考慮使用腹腔給藥，但在評(píng)價(jià)藥效時(shí)要注意這兩種給藥途徑是有差別的。 可采取瘤周、瘤內(nèi)、肌肉、皮下給藥途徑。腹水瘤試驗(yàn)時(shí)一般不能應(yīng)用腹腔給藥途徑。