移植NEP基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞對AD大鼠行為學(xué)的影響

阿爾茨海默病(Alzheimer disease ，AD)病理過程的關(guān)鍵問題是患者腦中p一淀粉樣多肽的異常增加和沉積。中性內(nèi)膚酶( NEP)是腦內(nèi)最重要的A p降解酶，是影響腦內(nèi)Ap分解代謝速率的限制因素。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell ， NSC)是具有向多種細(xì)胞系分化又具有自我更新能力的細(xì)胞。NSC、治療AD是運(yùn)用其特性修復(fù)和替代受損的神經(jīng)細(xì)胞，另外，NSCs是非常理想的基因載體，擁有許多其他載體所沒有的優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將NEP基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞移植到AD大鼠側(cè)腦室，觀察行為學(xué)的變化，為阿爾茨海默病的治療提供新的依據(jù)。

1材料和方法

1. 1實(shí)驗(yàn)動物

    清潔SD大鼠由佳木斯大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2主要試劑

胎牛血清、Ap1一40、神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基、神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基、神經(jīng)小球分散試劑盒等均購于美國Sigma公司。

1.3方法

1.3.1動物模型的建立

選左側(cè)海馬CAI區(qū)為注射區(qū):根據(jù)Pellegrino和Cusmhna的大鼠腦立體定位圖譜，確定本研究中的注射坐標(biāo)為前囪后3. 3mm，中線左側(cè)2. 2mm，硬腦膜下2. 8mm。用微量加樣器緩慢注射Ap一40溶液1 uL，之后緩慢撤針，充分消毒，縫合皮膚。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，待兩周后做細(xì)胞移植。

3. 2分組和細(xì)胞移植

30只AD大鼠在隨機(jī)分為3組，每組各10只:AD模型組、移植神經(jīng)干細(xì)胞組(NSCs組)和移植NEP基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞組(NEP一NSCs組)。選左側(cè)海馬C AI區(qū)在3組AD大鼠分別微量植入6},L細(xì)胞培養(yǎng)液、NSC懸液及NEP一NSC懸液(濃度約為1 x 105個細(xì)胞樞L)，注射完畢后，全層縫合頭皮，腹腔注射青霉素，術(shù)后放置于溫暖安靜處至清醒。每組大鼠術(shù)后第8周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3隱蔽平臺實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)期限為6d。實(shí)驗(yàn)前讓大鼠自由游泳1分。在水迷宮象限的中央固定隱蔽平臺的位置，將每只大鼠頭朝外壁在任何一個象限內(nèi)的隨機(jī)位置放入水中，大鼠爬到平臺上或到達(dá)60秒時，實(shí)驗(yàn)立即停止。大鼠自己爬到平臺或操作人員引導(dǎo)使其爬上平臺后停留10秒。每天訓(xùn)練4次，每次間隔30min。通過影像系統(tǒng)記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間即逃避潛伏期。此實(shí)驗(yàn)用于測量動物在水迷宮中的學(xué)習(xí)和記憶能力。

1.3.4空間探索實(shí)驗(yàn)

第7天在水迷宮中撤除平臺，將動物在任意一個入水點(diǎn)將放入水中，檢測60秒時間內(nèi)，大鼠出現(xiàn)在目標(biāo)象限(target quadrant } TQ)的百分比。此實(shí)驗(yàn)用來檢測動物保持記憶能力。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11. 3軟件分析，各組間統(tǒng)計分析應(yīng)用t檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。

2結(jié)果

2. 1行為學(xué)測試

與AD模型組相比，NEP一NSCs組和NSCs組的AD大鼠在第4,5,6天的平均潛伏期均明顯縮短(P < 0. OS)，以NEP一NSCs組尤為明顯，且NEP -NSCs組的AD大鼠在第4,5,6天的平均潛伏期亦明顯比NSCs組縮短(P<0. 05)

2. 2空間探索實(shí)驗(yàn)

與AD模型組相比，NSCs組和NEP一NSCs組AD大鼠在目標(biāo)象限探索時間的百分比有所增加，以NEP一NSCs組明顯，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0. 05 )。

3討論

    本實(shí)驗(yàn)中Ap海馬C AI區(qū)微量注射制備AD大鼠模型，將NEP基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞移植到AD模型大鼠側(cè)腦室區(qū)，通過隱蔽平臺獲得實(shí)驗(yàn)和空間搜索實(shí)驗(yàn)評價NEP基因轉(zhuǎn)染對AD大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:隱蔽平臺獲得實(shí)驗(yàn)中，與AD模型組相比，NEP一NSCs組和NSCs組在第4,5,6天的平均潛伏期均明顯縮短(P < 0. OS);與NSCs組相比，NEP一NSCs組第4,5,6天的平均潛伏期亦明顯縮短(P<0. OS )。這表明NEP一NSCs  組和NSCs組均能顯著改善AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能�？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，與AD模型組相比，NEP -NSCs組和NSCs組在TQ象限搜索時間的百分比有所增加，但無統(tǒng)計學(xué)意義。水迷宮實(shí)驗(yàn)表明，海馬移植了轉(zhuǎn)染NEP基因的神經(jīng)干細(xì)胞后，可以明顯改善AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能，原因是由于海馬移植了轉(zhuǎn)染NEP基因的的神經(jīng)干細(xì)胞后，可以高表達(dá)NEP蛋白，NEP蛋白是Ap降解酶，因此可以減少Ap在皮層及海馬區(qū)的沉積，降低了Ap對神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用。從而改善和提高了AD大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能。