——藍(lán)白克隆篩選

 

在分子克隆過程中，篩選含有插入基因片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子是一項(xiàng)必不可少的工作。一種稱為“藍(lán)白斑篩選”的顏色報(bào)告基因可以根據(jù)克隆顏色快速區(qū)分出重組和非重組的克隆。盡管藍(lán)白篩選提供了一個(gè)直觀的辨別重組克隆的方法，但是，在克隆挑取過程中，過多的人工操作過程存在主觀、速度慢、易出錯(cuò)等問題。

 

Molecular Devices QPix400系列微生物克隆篩選系統(tǒng)提供了一個(gè)自動(dòng)化的解決方案，尤其針對(duì)藍(lán)白克隆篩選，通過白光成像提供了準(zhǔn)確高效的克隆轉(zhuǎn)化檢測(cè)方法。這個(gè)解決方案整合了QPix Software2.0藍(lán)白篩選模塊、QPix顏色濾片以及可調(diào)平板適配器。

本文重點(diǎn)描述了使用QPix420系統(tǒng)進(jìn)行顏色克隆篩選實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，通過DNA測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證了挑取克隆的準(zhǔn)確性。

 

· 通過白光高效監(jiān)控轉(zhuǎn)化效率

· 準(zhǔn)確區(qū)分白色、藍(lán)色或淺藍(lán)色等顏色

·  智能化軟件選擇模塊，可以自動(dòng)或自定義篩選

 

藍(lán)白克隆篩選的分子機(jī)理依賴于LacZ報(bào)告基因，非重組的克隆具有一個(gè)編碼B-半乳糖苷酶的功能LacZ基因。該酶分子聯(lián)合宿主菌體表達(dá)的互補(bǔ)片段，可以將培養(yǎng)基中的X-gal轉(zhuǎn)化為深藍(lán)色的5-溴-4-靛藍(lán)。相反，成功插入外源片段的重組質(zhì)粒，LacZ基因失活，克隆顏色變?yōu)榘咨?Figure 1所示)。

 

 

 

 

Figure 1. 經(jīng)典藍(lán)白克隆篩選流程示意圖：藍(lán)白篩選細(xì)菌克隆過程包括將外源基因片段插入到一個(gè)含有抗性和LacZ基因的質(zhì)粒載體；插入位點(diǎn)為質(zhì)粒載體上LacZ基因內(nèi)部的多克隆位點(diǎn)；轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli，菌體、載體以及培養(yǎng)基中的X-gal聯(lián)合作用形成藍(lán)色或白色克隆。

 

使用分子克隆方法構(gòu)建重組載體克隆

作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ�，人胰島素樣生長因子(IGF)基因被克隆到pUC57-Kan載體的多克隆位點(diǎn)(Figure 2A)。然后，將載體和基因片段(Human IGF)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E . coli 化學(xué)感受態(tài)(One Shot® TOP10, Life Technologies)。最后將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌涂布到含有卡那霉素、IPTG和X-gal的LB平板，37度過夜培養(yǎng)。含有載體和插入片段或沒有插入片段的克隆，分別顯示為白色和藍(lán)色克隆(Figure 2B)。

 

 

生長好的藍(lán)白克隆平板放入可調(diào)平板適配器，然后一起放置到機(jī)器成像平臺(tái)上，平板和適配器下面為QPix顏色濾片(Figure 3A)；可調(diào)適配器上的彈性插銷，可以壓緊培養(yǎng)皿平板，確保成像過程中不會(huì)移位(Figure 3B)；QPix420白光下對(duì)平板成像(Figure 3C)。

 

 

自動(dòng)識(shí)別藍(lán)白克隆

QPix420系統(tǒng)白光成像的圖片通過QPix software2.0軟件分析后，藍(lán)色(Figure 4A)或者白色(Figure 4B)克隆可以被自動(dòng)識(shí)別，通過軟件內(nèi)置的自動(dòng)選取模塊可以分別被挑取(Figure 4C)。用戶可以通過柱狀圖調(diào)整篩選閾值以及定義不同篩選參數(shù)，如邊緣形狀、軸比、直徑及距離等，手動(dòng)更改獲得最佳篩選效果。軟件選取的藍(lán)色和白色克隆， 可以通過QPix420系統(tǒng)內(nèi)置的96挑針挑頭自動(dòng)化挑取。

 

 

DNA測(cè)序驗(yàn)證挑取的克隆

藍(lán)色和白色克隆的識(shí)別和挑取準(zhǔn)確性通過DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。通過測(cè)序證明98%的挑取到的白色克隆在載體pUC57-Kan中都含有人IGF基因插入片段。此外，100%的挑取的藍(lán)色克隆都含有空的pUC57-Kan載體，沒有插入基因片段。通過上面實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以證明QPix400系列微生物克隆篩選系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確區(qū)分藍(lán)白克隆顏色，并準(zhǔn)確挑取，是一個(gè)可靠的藍(lán)白克隆篩選方法。

藍(lán)白克隆篩選是一個(gè)通過顏色區(qū)分來快速識(shí)別是否含有插入序列重組克隆的直觀方法。Molecular Devices提供了一個(gè)自動(dòng)化的藍(lán)白克隆篩選方案。QPix400微生物克隆篩選系條通過QPix software2.0友好的用戶界面配合顏色濾片，能夠在白光下即可準(zhǔn)確區(qū)分克隆顏色。QPix400系統(tǒng)已經(jīng)成為一個(gè)高效可靠的替代傳統(tǒng)人工篩選克隆的自動(dòng)化平臺(tái)。