在藥物研發(fā)早期進(jìn)行心急毒性評價是非常重要的，以便于排除潛在的有毒副作用的化合物，從而開展進(jìn)一步的研究。高度預(yù)測性的生物相關(guān)性體外高通量篩選分析實(shí)驗(yàn)對于提高效率和降低心臟安全性評價失敗的化合物篩選的高成本來說是至關(guān)重要的。干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞是特別完美的細(xì)胞模型，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)了GPCRs 和離子通道，表現(xiàn)出自發(fā)的類似原始心肌細(xì)胞的機(jī)械的和電學(xué)活性。

 

EarlyTox^TM心急毒性試劑盒包含一個新型的鈣離子敏感染料和一個專有的進(jìn)過優(yōu)化的屏蔽技術(shù)，用來檢測與心肌細(xì)胞跳動關(guān)聯(lián)的的胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的變化。跳動模式的信號特征表現(xiàn)時間很短。由于相機(jī)曝光時間短,細(xì)胞內(nèi)的鈣離子結(jié)合染料產(chǎn)生的信號比標(biāo)準(zhǔn)的鈣流分析實(shí)驗(yàn)小。這種新配方的試劑盒比其它商用鈣染料能提供更強(qiáng)的信號。如圖1 中所示，起到屏蔽作用的分子不會進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，但降低了細(xì)胞外背景熒光信號。這些特性有助于提高信號窗口，為心肌跳動波形圖檢測提供更多詳細(xì)信息。

 

 

 

 

這個檢測分析試劑盒可用于分析藥物對峰值頻率（BPM）、峰值幅度和跳動波形圖的影響，且被設(shè)計(jì)為用于干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞或原代心肌細(xì)胞。峰值頻率取決于EarlyTox 心肌毒性染料監(jiān)測的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。在單個的心跳周期內(nèi)，肌質(zhì)網(wǎng)被激活后Ca²⁺被釋放進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)。鈣結(jié)合肌鈣蛋白激活肌小節(jié)，引起細(xì)胞收縮。同步地，細(xì)胞中染料分子與游離的鈣離子結(jié)合增加了熒光信號強(qiáng)度。

 

心肌細(xì)胞舒張發(fā)生于鈣離子泵把細(xì)胞內(nèi)的鈣離子攝取回肌質(zhì)網(wǎng)并和細(xì)胞外液進(jìn)行鈣離子交換時。熒光信號強(qiáng)度隨著鈣離子濃度降低而減小。隨著下一個心跳周期重復(fù)開始，熒光信號峰值隨著心跳同步被記錄。

 

使用EarlyTox^TM心急毒性試劑盒在FLIPR^Tetra 系統(tǒng)中已經(jīng)對心肌細(xì)胞的鈣離子峰值頻率和非典型波形圖的濃度依賴性調(diào)控方式進(jìn)行了驗(yàn)證， 并通過ScreenWorks®Peak Pro 軟件作進(jìn)一步的分析。確證參數(shù)的改變，如鈣離子峰值頻率、振幅、峰寬、增長和衰減的時間有助于對構(gòu)效關(guān)系（SAR）方向修正或者排除化合物進(jìn)入藥物化學(xué)或臨床前研發(fā)的評判。另外，這種方法還可以用于作用于心臟的新化合物開發(fā)。

 

在生物相關(guān)性心急毒性分析實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行功能性研究

最大限度減少染料對心肌細(xì)胞跳動特性的非特異性影響

在最大的可用信號中觀察時間分辨率

無需幾小時，在數(shù)分鐘內(nèi)檢測384 個樣品

 

本實(shí)驗(yàn)中所使用的心肌細(xì)胞，來源于Cellular Dynamics International 的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS）分化的心肌細(xì)胞，根據(jù)建議的方案進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞被培養(yǎng)在黑壁底透的384 孔板中10~14 天。EarlyTox Cardiotoxicity Explorer Kit (R8210) 染料加載緩沖液加熱至37°C 以避免降低心肌細(xì)胞的跳動。加入25μL 染料至多孔板中每孔25μL 的細(xì)胞體系中。細(xì)胞板放置于5% CO2，37℃條件下孵育2 小時。

 

試劑盒中含有三個參考化合物——普萘洛爾、異丙腎上腺素和索他洛爾，用于驗(yàn)證iPS C 心肌細(xì)胞不同刺激下的反應(yīng)狀態(tài)。準(zhǔn)備好的化合物板中藥物的每個檢測濃度是終濃度的5 倍并在加樣前加熱至37℃，以減少溫度對細(xì)胞的影響。當(dāng)在FLIPR^Tetra中系統(tǒng)添加化合物后，可以對細(xì)胞跳動頻率和波形圖觀察記錄持續(xù)4~6 小時�；�合物添加后繼續(xù)記錄10 分鐘�？梢灶~外記錄讀取幾個時間點(diǎn)直至4 個小時的信號。

 

對照和EarlyTox 心肌試劑盒中的三個參考化合物的峰值頻率和跳動波形圖實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2~5。

 

 

 

多種鈣離子指示染料以及其各自在細(xì)胞跳動、平均峰值振幅以及峰值頻率等方面的作用進(jìn)行了4小時長時間的實(shí)驗(yàn)比較。這些染料包括EarlyTox心急毒性染料, FLIPR. Calcium 5 試劑盒 (Molecular Devices)和Fluo-4 Direct 試劑盒(Invitrogen)。根據(jù)供應(yīng)商產(chǎn)品說明，染料加入iPSC 心肌細(xì)胞中共孵育。使用FLIPRTetra系統(tǒng)對加樣前和加樣后幾個時間點(diǎn)的結(jié)果進(jìn)行記錄。此實(shí)驗(yàn)中同時設(shè)置了對照孔。如圖6 和7 中所示， 所有EarlyTox 心急毒性染料的峰值頻率和信號振幅均是最高的。圖8 中可以看到，EarlyTox 心急毒性染料對化合物添加后4 小時內(nèi)細(xì)胞跳動能力（消失）沒有影響。FLIPR Calcium 5 染料作用下的多數(shù)細(xì)胞停止跳動，而Fluo-4 Direct 染料在加入化合物90 分鐘后所有孔均停止跳動。

 

 

 

 

 

 

EarlyTox 心肌毒性染料已進(jìn)行優(yōu)化，可以提供更強(qiáng)信號、高通量方法來檢測藥用化合物對干細(xì)胞分化的心肌細(xì)胞的效應(yīng)。優(yōu)化了的染料成分可以產(chǎn)生更大的信號窗口和顯著的降低試劑自身對心肌跳動、峰值頻率或信號振幅等隨著時間變化的很小的非特異性毒性作用，有別與其它類型的試劑染料。EarlyTox 心肌毒性染料配套FLIPRTetra 系統(tǒng)使用，是藥物研發(fā)早期檢測化合物心肌毒性和確證潛在心臟候選藥物發(fā)現(xiàn)的強(qiáng)大工具。