PCR新手指南：最佳復(fù)性溫度的選擇標(biāo)準(zhǔn)

最佳復(fù)性溫度的選擇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該是可擴(kuò)增范圍的中間溫度。

在使用溫度梯度的方法尋找最佳復(fù)性溫度時，新手往往會選擇擴(kuò)增產(chǎn)物最多的溫度條件，然而在此后的非梯度擴(kuò)增時擴(kuò)增效果又不太理想。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的主要原因是最佳復(fù)性溫度的選擇標(biāo)準(zhǔn)不對。本人10多年前做過數(shù)千個基因的擴(kuò)增，通過溫度梯度實驗發(fā)現(xiàn)，能擴(kuò)增出來的溫度范圍一般在3-30度。選擇的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該是可擴(kuò)增范圍的中間溫度。
因為：
1、擴(kuò)增產(chǎn)物量的影響因素很多，有些是隨機(jī)的。從定量PCR的平臺期高低的不規(guī)律可以看出來。
2、不同儀器、不同位置的溫度及溫度變化曲線是有差異的。按照儀器廠家的出廠標(biāo)準(zhǔn)也準(zhǔn)確性+-0.3度及均勻性+-0.3度
3、PCR儀進(jìn)行梯度擴(kuò)增時的溫度準(zhǔn)確性會更差


選擇中間溫度可以消除儀器溫度差的影響。


另外，進(jìn)行溫度梯度時模板量的選擇也是非常重要的。