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高內(nèi)涵成像技術(shù)在單抗結(jié)合檢測中的應(yīng)用-Molecular Devices ImageXpress MicroXLS

瀏覽次數(shù)：2537　發(fā)布日期：2014-3-26　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

高內(nèi)涵成像技術(shù)在單抗結(jié)合檢測中的應(yīng)用

優(yōu)點(diǎn)

1.無需沖洗的檢測方法提高效率，減小浪費(fèi)

2.應(yīng)用范圍廣，可用于貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞及免疫磁珠

3.可用任何波長的熒光標(biāo)記

4.高敏感度可檢測低豐度抗原

單抗結(jié)合檢測方法的發(fā)展大大提高了細(xì)胞及免疫磁珠的高通量，高內(nèi)涵分析效率。這種不用沖洗，基于熒光微孔分析技術(shù)（fluorometric microvolume assay technology, FMAT）的方法可以快速的針對更少量的細(xì)胞進(jìn)行篩選，而且在傳統(tǒng)樣本檢測中由于多次洗板造成的細(xì)胞損失也完全可以避免。

抗體的發(fā)現(xiàn)在診斷疾病，研發(fā)疫苗和治療疾病的過程中起到重要作用。研究者們利用雜交瘤細(xì)胞或者形成克隆來篩選高表達(dá)克隆株，檢測細(xì)胞表面的抗體結(jié)合效率，觀測抗體或配體在細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)化。在傳統(tǒng)的FMAT檢測方法的已有優(yōu)點(diǎn)之上，利用ImageXpress® Micro 寬場高內(nèi)涵分析系統(tǒng)進(jìn)行操作的單抗結(jié)合檢測方法可以讓科學(xué)家們在同一個(gè)平板孔中檢測多種不同細(xì)胞的表面抗體結(jié)合情況。這一系統(tǒng)也可以將檢測規(guī)模提升到1536孔板，并且只需要2-3微升的樣本。即使用更低的二抗?jié)舛�，其檢測范圍和靈敏度也不會下降，甚至有所提高。

檢測原理

抗體被富集在磁珠上并用帶熒光的二抗進(jìn)行標(biāo)記。熒光成像技術(shù)可以檢測被磁珠捕獲的抗體數(shù)量。利用類似的方法同樣可以檢測細(xì)胞表面結(jié)合的配體以及配體和抗體的內(nèi)化。

在單抗結(jié)合檢測過程中（圖1），應(yīng)將貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞或抗體包被磁珠樣本加入到96,384,1536孔板中。然后加入一抗（目標(biāo)抗體），接著用二抗對一抗進(jìn)行標(biāo)記來檢測一抗的結(jié)合情況。

所有的檢測試劑加到微孔板后都無需沖洗。細(xì)胞或抗體包被的免疫磁珠被固定在孔板底部表面，即使孔板底部有高背景熒光，陽性信號也可被識別并分析。

線性和檢測范圍

在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，我們將不同濃度的一抗滴定使之與7微米的磁珠結(jié)合。加入被分析物，用二抗標(biāo)記并利用ImageXpress Micro 高內(nèi)涵分析系統(tǒng)成像。傳統(tǒng)的FMAT檢測方法只能利用紅色（Cy5）通道進(jìn)行檢測，而ImageXpress Micro系統(tǒng)可以捕捉到多種波長圖像，所以任何二抗標(biāo)簽都可以用來標(biāo)記及檢測。在這個(gè)滴定實(shí)驗(yàn)中，二抗是用DyLight 488標(biāo)記的。

MetaXpress® 高內(nèi)涵圖像采集和分析軟件中應(yīng)用Count Nuclei 模塊對圖像進(jìn)行分析，所得出的最低檢測閾值（LLD）為0.5ng/ml（30pg/well），線性響應(yīng)大概在1-31ng/ml。此次一抗滴定實(shí)驗(yàn)的曲線顯示出了“前帶現(xiàn)象（prozone）”，以及與單抗結(jié)合檢測相關(guān)的“鉤狀現(xiàn)象（hook effect）”。在曲線頂峰的信號衰減是由于未結(jié)合的一抗在介質(zhì)中與二抗結(jié)合，使之未能與細(xì)胞和磁珠結(jié)合所致（圖2）。

免疫磁珠的一抗結(jié)合曲線見上圖。12.7微米包被羊抗小鼠抗體的磁珠被結(jié)合到不同濃度的小鼠lgG抗體上，并加到微孔板中，在孔板中與標(biāo)記AlexaFluor488的二抗室溫下共孵育1-2個(gè)小時(shí)，實(shí)驗(yàn)設(shè)四個(gè)復(fù)孔及同型抗體對照孔。圖像為10X PlanFluor物鏡拍攝。孔板的縮略圖（下）清晰的顯示出抗體結(jié)合的濃度梯度。分析結(jié)果：LLD 為0.5 ng/mL (30 pg/well)，在1-31ng/mL之間呈線性關(guān)系。

多波長分析更準(zhǔn)確的測定細(xì)胞響應(yīng)

除了熒光圖像外，ImageXpress Micro系統(tǒng)還可以捕捉到透射光圖像（transmitted light, TL）從而更準(zhǔn)確的鑒別細(xì)胞。在這個(gè)基于細(xì)胞的檢測例子中，系統(tǒng)同時(shí)捕捉了透射光和熒光圖像，并用MetaXpress 軟件的用戶自定義模塊對細(xì)胞進(jìn)行分析。

對同一個(gè)孔的熒光圖像觀察顯示抗體已經(jīng)結(jié)合到了細(xì)胞表面，但是如果將熒光和透射光圖像疊加就可以看到并非每個(gè)細(xì)胞都和抗體結(jié)合在一起（圖3，左上）。隨后的圖像分析正確的篩選出了與抗體結(jié)合的陽性細(xì)胞（圖3，右上）。另一個(gè)孔的Cy5通道圖像顯示出高熒光信號，意味著抗體的有效結(jié)合。然而，通過透射光和熒光的疊加分析可以看出此孔中的細(xì)胞并未與熒光有效結(jié)合（圖3，左下）。圖像分析確定了這些高熒光信號是由人為因素而非細(xì)胞本身引起的，所以這些細(xì)胞被標(biāo)記為未連接到抗體（圖3，右下）。

上：Cy5（紅色）和透射光（半透明）圖像疊加后顯示出所有抗體結(jié)合的陽性和陰性細(xì)胞（左）。分析圖中將抗體結(jié)合的陰性細(xì)胞顯示為黃色，陽性細(xì)胞（Cy5通道）顯示為藍(lán)色，重疊的部分為白色（右）。

下：Cy5（紅色）和透射光（半透明）圖像疊加后顯示出沒有與細(xì)胞重疊的雜質(zhì)熒光（左）。分析圖中將抗體結(jié)合的陰性細(xì)胞顯示為黃色， Cy5通道陽性但與細(xì)胞無關(guān)的雜質(zhì)顯示為粉色（右）。

檢測實(shí)驗(yàn)可以很容易的通過優(yōu)化二抗?jié)舛葋泶_定條件。在這個(gè)例子中，我們用三種不同濃度的二抗來結(jié)合寬濃度范圍的一抗。就如之前的磁珠檢測結(jié)果一樣，實(shí)驗(yàn)顯示出了很好的“鉤狀現(xiàn)象（hook effect）”（圖4，上）。當(dāng)二抗?jié)舛葹?.25µg/mL時(shí)的最低檢測閾值為0.5ng/ml，這一數(shù)值與標(biāo)準(zhǔn)的FMAT方法一樣。三種濃度的二抗在滴定范圍內(nèi)都顯示出了良好的線性（圖4，下）。

上：三種不同濃度二抗的一抗滴定實(shí)驗(yàn)（顯示于X軸）。

下：結(jié)果表明，分析物（一抗）在五倍稀釋梯度下呈線性關(guān)系，其LLD為0.5ng/mL

基于圖像的單抗檢測分析更具靈活性

與傳統(tǒng)的FMAT檢測方法相比，應(yīng)用ImageXpress Micro系統(tǒng)和 MetaXpress軟件的單抗結(jié)合高內(nèi)涵成像分析方法可以提供更多的信息。本系統(tǒng)可以在消除通常人為誤差的基礎(chǔ)上更快速的得到準(zhǔn)確的細(xì)胞響應(yīng)，從而得到更精確的結(jié)果。另外，科學(xué)家們可以檢測配體與細(xì)胞表面的結(jié)合并進(jìn)一步在任意波長檢測二抗標(biāo)簽，在一個(gè)平板上檢測不同細(xì)胞以及在不影響靈敏度的情況下將檢測擴(kuò)展到1536孔板。

發(fā)布者：美谷分子儀器（上海）有限公司
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