使用UNIFI天然產物整體解決方案:鑒定未知中藥片劑中的化學成分及推測其所含藥材

喬立瑞¹、Rob Lewis²、Alex Hooper²、James Morphet²、譚曉杰¹、Kate Yu³
1、沃特世科技（上海）有限公司，上海，中國
2、沃特世公司質譜技術中心，曼徹斯特，英國
3、沃特世公司，馬塞諸塞州米爾福德市，美國

運用超高效液相色譜（ACQUITY UPLC® I-Class）、四級桿飛行時間質譜 （Xevo® G2-S QTof）及UNIFI®天然產物整體解決方案鑒定未知中藥片劑中的化學成分并推測其所含藥材。這一UNIFI對未知物組分鑒定和可能藥材推測的整體工作流程大大提高了未知中藥體系組分定性工作的準確性及效率。

背景介紹:
中藥是一個極其復雜的物質體系，其發(fā)揮作用的物質基礎主要是藥材中的化學成分。應用紀要"使用UNIFI整體解決方案分析綠茶中的化學組分"（文獻編號：720004840zh）中，我們已經闡述了如何應用UNIFI整體解決方案結合中藥數據庫來快速鑒定已知藥材樣品中的化學成分。對此類樣品只需從UNIFI中藥數據庫導入相關的藥材成分，并以它們?yōu)樗阉髂繕藢λ�得數據進行比對從而得出匹配成分列表并加以確證。此工作流程思路明確，步驟相對簡單。

然而，人們在實際工作中往往需要對一些完全未知的樣品進行化學成分分析，并要推測其中可能含有的中藥材，這類工作的難度就很大，有時甚至不知從何入手。由于已知背景信息近乎于零，運用目前最常見的液質聯用儀的分析即使得到大量數據，如何從龐大信息中縮小目標范圍快速找到有用信息仍是所有科研人員共同面對的最大挑戰(zhàn)。

對于未知中藥產品的組分研究，傳統的工作流程是：研究人員手工提取每個色譜峰，通過精確分子量來推導可能的分子式。然后根據分子式檢索在線數據庫，并且需要通過相關的二級碎片推導其可能的裂解途徑，進而確定結構。該研究思路由點到面，這一系列環(huán)節(jié)中，不僅很多步驟需要研究人員的直接介入，同時對研究人員的化學背景要求很高，需要不斷從信息的海洋中尋找答案。

UNIFI天然產物整體解決方案提出了一套新的全方位解決問題的思路。它以超高效液相色譜 (ACQUITY UPLC I-Class) 與四級桿飛行時間質譜 （Xevo G2-S QTof）為基礎，對樣品進行非數據依賴的MS^E數據采集，將所得數據與UNIFI中藥數據庫進行比對，所匹配成分結構以其相應碎片經MassFragment™確證，最終通過預設的工作流程模版自動顯示出所鑒定樣品組分的詳細信息。

本應用紀要便以未知物中藥片劑為例闡述了如何采用UNIFI天然產物整體解決方案鑒定未知樣品中的化學成分并推測其中可能的藥材。

關鍵詞:
未知中藥產品成分分析、未知中藥產品藥材推測與確證、UNIFI 天然產物整體解決方案、UNIFI 中藥數據庫、UPLC/QTof MS、 MS^E、UNIFI 天然產物工作流程、丹參、三七

實驗條件：

樣品處理：
將未知中藥片劑兩片，去包衣，研成粉末狀，取500 mg溶解于50 mL MeOH:H₂O（3:1），超聲溶解5min，并以0. 45 μm薄膜過濾，備用。

液相色譜條件：
儀器： ACQUITY UPLC I-Class with FTN Sample Manager
色譜柱： ACQUITY UPLC HSS T3， 2.1 x 100 mm， 1.8 μm， 40℃
樣品室溫度： 15 ℃
流動相 A： 水（0.1% 甲酸）
流動相B：乙腈

梯度：

質譜條件：
儀器： Xevo G2-S QTof MS
采集質量范圍： 100-1500 Da
掃描時間： 0.1 S
采集模式： ESI+和 ESI-分辨率模式，MS^E
Lock mass： 亮氨酸腦啡肽（LE）1 ppm（0.3 S 掃描，間隔：15 S）
毛細管電壓： 3 KV （ESI+）/ 2.5 KV （ESI-）
錐孔電壓： 100V
碰撞能量（eV）： low CE：6 /High CE：20-50
電離源溫度： 120 ℃
脫溶劑溫度： 500 ℃
錐孔氣流速： 30 L/h
脫溶劑氣流速： 1000 L/h
數據采集時間： 17 min

結果:
采用超高效液相色譜（UPLC I-Class）與四級桿飛行時間質譜 （Xevo G2-S QTof）對未知物中藥片劑的相關化學成分進行分離以及質譜數據的采集。利用UNIFI天然產物整體工作流程結合整個中藥數據庫進行數據處理，軟件自動鑒定288個組分，經MassFragment初步確證了其中含量較高的37個主要成分。通過已被確定化學成分與藥材的關聯分析, 推測未知片劑中可能含有藥材丹參及三七。通過網絡搜索含此二味藥材的已知中藥成方將可能相關的藥材在中藥數據庫中所列成分與實驗數據再次比對，確證了該未知中藥片劑中的59個主要成分皆來自丹參與三七。最終結論：該片劑主要只含有丹參和三七兩種藥材，很可能是三七丹參片或復方丹參片。

討論:
UNIFI天然產物整體解決方案包括ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜、Xevo G2-S QTof四級桿飛行時間質譜以及含中藥數據庫的UNIFI 軟件信息平臺。對于已知中藥材成分分析的工作流程已經在應用紀要應用UNIFI整體解決方案鑒定綠茶提取物化學成分（ 部件編號：720004837zh）中進行了詳細闡述。對完全未知的樣品，則需在采用該工作流程的基礎上加入藥材推斷，在線檢索可能的中藥成方，以及從UNIFI中藥數據庫再次導入相關藥材信息并進行再確證的步驟。圖1顯示了完整的未知物組分鑒定的工作流程。

圖1 未知物中藥復方組分鑒定的工作流程

圖2a是以二維圖象顯示的該未知中藥片劑的UPLC/QTof MS基峰離子圖（BPI），UNIFI平臺亦可將同樣的結果以三維圖象顯示（圖２b）．與圖2a所示的二維圖譜相比，三維圖象信息更豐富真實，可以更直觀的了解整個樣品的組分分布輪廓。比如從圖中我們可以很快斷定該樣品化學組分的分子量分布范圍主要集中在400-1000 Da。除此以外，也可以初步觀察整個樣品內化合物的共流出狀況。

這一三維圖譜是通過UNIFI獨有的Apex 3D圖象掃描的方式產生，除直觀效果以外，更有助于提高后期定量定性工作的準確性，并且對噪音的識別與排除有較強的優(yōu)勢。

圖2a 未知物中藥片劑的UPLC/QTof MS基峰離子圖（BPI）

圖2b 未知物中藥片劑的3D質譜圖

UNIFI天然產物整體解決方案工作流程有如下特點：１，從色譜峰的提取、分子式的確定、中藥數據庫的搜索、二級碎片的匹配到組分的初步鑒定全部由軟件自動完成； ２，研究人員僅僅需要對MassFragment已自動給出的碎片信息，初步的判斷其合理性；３，如果懷疑假陽性或有組分未被匹配，研究人員再進行手動鑒定。

與傳統的研究模式相比較，UNIFI天然產物整體解決方案將大量的數據篩選工作，即從信息的海洋中尋找有用目標這個一直靠研究者手動操作的甁頸變成了軟件的自動化流程，大大降低了研究人員的工作量，同時極大減少了這項工作的盲目性，從而使效率大大提高。

圖3顯示了未知中藥片劑成分鑒定的結果界面（圖３）。3a UNIFI天然產物的整體工作流程模版；3b 組分鑒定列表；3c與3b相對應的單個組分選擇離子色譜圖；3d與3c相對應的質譜圖

圖3 顯示了UNIFI軟件處理后未知中藥片劑成分鑒定的結果界面。在最初得到的成分列表中（3a），同一個保留時間的色譜峰可能含有多個同分異構體。此時需要通過化合物的加合離子，以及其相應的二級碎片信息（藍色的圖表）進一步排查推斷所鑒定化合物的合理性。例如軟件所自動鑒定的保留時間為7.54分鐘的色譜峰為人參皂苷Rb1或Yesanchinoside E，此時點擊圖3d便可看到其相應的放大圖（圖4）。 因MassFragment已經對該化合物的二級碎片結構進行自動匹配，研究人員可以很直觀快速的觀察碎片斷裂的合理性。該化合物的裂解自糖苷鍵的斷裂到最終原人參二醇苷元碎片的生成，都表明人參皂苷Rb1的結構更為合理。故可將人參皂苷Rb1定義為Confirmed。

圖４ 組分人參皂苷Rb1的二級碎片離子的MassFragment的匹配結果

經過以上組分確證后，可以看到該未知物片劑中，含有人參皂苷，丹參酚，丹參酮，三七皂苷等化合物類型，經組分與藥材的關聯顯示，該未知物片劑中可能含有原料藥材丹參及三七。 通過在線網絡搜索，發(fā)現可能含有這兩種藥材的中藥成方有三七丹參片，復方丹參片。當然還發(fā)現了含這兩種藥材外的其他配伍方劑，比如它們與西洋參或山楂等配伍的方劑。

再下一步的工作便已經由開始的無目標篩查，轉變?yōu)閷σ阎�藥材進行組分分析。其流程步驟與應用紀要“應用UNIFI整體解決方案鑒定綠茶提取物化學成分”（文獻編號：720004840zh）完全相同。 即將目標藥材（丹參、三七、西洋參、山楂）從中藥數據庫導入與實驗數據再次比對，結果沒有發(fā)現與西洋參和山楂的特征組分相匹配的色譜峰（如西洋參皂苷、絞股藍皂苷、山楂皂苷等特征組分），由此進一步確認該片劑中不含西洋參和山楂。同時所得樣品主要色譜峰均能與丹參和三七的主要成分匹配（確證了59個主要組分），見表1。最終得出結論：該片劑中含丹參和三七藥材，很有可能是三七丹參片或復方丹參片。

表1 通過導入天然產物組分信息總覽模板自動得到的未知物片劑中組分鑒定概況報告

結論：
該應用紀要闡述了UNIFI天然產物整體解決方案應用于對未知物組分鑒定和可能藥材推測的整體工作流程，該工作流程是一個從開始的無目標篩查逐步轉化為有目標分析的過程。

UPLC/QTof MS 樣品分析時間只需17分鐘。前期無目標篩查初步鑒定主要化學成分37種，推斷相關藥材為三七與丹參。經網絡搜索已知中藥成方，將可能相關藥材（丹參, 三七, 西洋參, 山楂）再以有目標篩查方式與實驗數據再次比對。結果，中藥數據庫中所列丹參和三七化學成分共103種，其中有59種主要成分與所得數據匹配并得到確認，而其余兩味藥材所含主要成分找不到合理匹配。最終結論：所檢測未知中藥片劑極可能是三七丹參片或復方丹參片。

UNIFI天然產物整體解決方案輔以中藥數據庫并結合組分結構的自動鑒定功能是嶄新的中藥復雜組分分析的解決方案。為復雜中藥復方制劑，尤其是完全未知的樣品的組分定性工作提供了新的思路，最終減少該類研究的盲目性，大大提高效率。