多光子共聚焦掃描顯微鏡的原理以及應(yīng)用
多光子共聚焦顯微鏡是光學(xué)顯微鏡的重大改進(jìn)，主要表現(xiàn)為可以觀察活細(xì)胞、固定細(xì)胞和組織的深層結(jié)構(gòu)，并且可以得到清晰銳利的多層Z平面結(jié)構(gòu)，即光學(xué)切片，并以此可以構(gòu)建標(biāo)本的三維實體結(jié)構(gòu)。共聚焦顯微鏡采用激光光源，經(jīng)過擴(kuò)充后充滿整個物鏡后焦平面，然后經(jīng)過物鏡的透鏡系統(tǒng)，在標(biāo)本的焦平面上會聚成非常小的點。根據(jù)物鏡數(shù)值孔徑不同，最亮照明點直徑大小約0.25 ~ 0.8μm，深度約0.5 ~ 1.5μm。共聚焦點大小決定于顯微鏡設(shè)計、激光波長、物鏡特性、掃描單元狀態(tài)設(shè)定和標(biāo)本性質(zhì)。場式顯微鏡的照明范圍和照明深度都很大，而共聚焦顯微鏡的照明則集中到焦平面上的一個精確的焦點上。共聚焦顯微鏡最基本的優(yōu)點是可以對厚熒光標(biāo)本（可以達(dá)到50 μm或以上）進(jìn)行精細(xì)的光學(xué)切片，切片的厚度約為0.5到1.5μm。系列光學(xué)切片圖像可以通過精確的顯微鏡Z軸步進(jìn)馬達(dá)上下移動標(biāo)本獲得。圖像信息的采集被控制在精確的平面內(nèi)，而不會被位于標(biāo)本上其他位置發(fā)出的信號干擾。在去除背景熒光影響和增加信噪比后，共聚焦圖像的對比度和分辨率比傳統(tǒng)場式照明熒光圖像有明顯的提高。在很多標(biāo)本中，許多錯綜的結(jié)構(gòu)成分相互交織構(gòu)成復(fù)雜的系統(tǒng)，僅用幾張光學(xué)切片很難還原標(biāo)本本身的結(jié)構(gòu)特征，但是一旦能夠采集到足夠的光學(xué)切片，我們就能通過軟件對其進(jìn)行三維重建。這種實驗方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用與生物學(xué)研究中，用來闡明細(xì)胞或組織之間復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系。
與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，多光子共聚焦顯微鏡具有更高的分辨率，實現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r觀察并可形成清晰的三維圖象等優(yōu)點。所以它問世以來在生物學(xué)的研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。在對生物樣品的觀察中，多光子顯微鏡有其優(yōu)越性：對活細(xì)胞和組織或細(xì)胞切片進(jìn)行連續(xù)掃描，可獲得精細(xì)的細(xì)胞骨架、染色體、細(xì)胞器和細(xì)胞膜系統(tǒng)的三維圖像�？梢缘玫奖绕胀晒怙@微鏡更高對比度、高解析度圖象、同時具有高靈敏度、杰出樣品保護(hù)。多維圖象的獲得，如7 維圖象(XYZaλIt): xyt、xzt 和xt 掃描,時間序列掃描旋轉(zhuǎn)掃描、區(qū)域掃描、光譜掃描、同時方便進(jìn)行圖像處理。細(xì)胞內(nèi)離子熒光標(biāo)記，單標(biāo)記或多標(biāo)記，檢測細(xì)胞內(nèi)如PH和鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率測定及動態(tài)變化。熒光標(biāo)記探頭標(biāo)記的活細(xì)胞或切片標(biāo)本的活細(xì)胞生物物質(zhì)，膜標(biāo)記、免疫物質(zhì)、免疫反應(yīng)、受體或配體，核酸等觀察；可以在同一張樣品上進(jìn)行同時多重物質(zhì)標(biāo)記，同時觀察。對細(xì)胞檢測無損傷、精確、準(zhǔn)確、可靠和優(yōu)良重復(fù)性；數(shù)據(jù)圖像可及時輸出或長期儲存。
當(dāng)前，激光共聚焦顯微鏡較廣泛應(yīng)用的研究領(lǐng)域有：細(xì)胞生物學(xué)：如：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流動性、受體、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化、細(xì)胞凋亡機(jī)制；各種細(xì)胞器、結(jié)構(gòu)性蛋白、DNA、RNA、酶和受體分子等細(xì)胞特異性結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進(jìn)行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗體對紫外線引起的DNA損傷進(jìn)行觀察和定量；分析正常細(xì)胞和癌細(xì)胞骨架與核改變之間的關(guān)系；細(xì)胞黏附行為等。生物化學(xué)：如酶、核酸、受體分析、熒光原位雜交、雜色體基因定位等，利用共聚焦技術(shù)可以取代傳統(tǒng)的核酸印跡染交等技術(shù)，進(jìn)行基因的表達(dá)檢測，使基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯等檢測變的更加簡單、準(zhǔn)確。藥理學(xué)：如藥物對細(xì)胞的作用及其動力學(xué)；藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程、定位分布及定量。生理學(xué)、發(fā)育生物學(xué)：如膜受體、離子通道、離子含量、分布、動態(tài)；動物發(fā)育以及胚胎的形成，骨髓干細(xì)胞的分化行為；細(xì)胞膜電位的測量，熒光漂白恢復(fù)（FRAP）的測量等。遺傳學(xué)和組胚學(xué)：如細(xì)胞生長、分化、成熟變化、細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)、染色體分析、基因表達(dá)、基因診斷。神經(jīng)生物學(xué)：如神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運輸和傳遞。微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)：如細(xì)菌、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)。病理學(xué)及病理學(xué)臨床應(yīng)用：如活檢標(biāo)本的快速診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病的診斷。免疫學(xué)、環(huán)境醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)：如免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三標(biāo)）的定位，細(xì)胞膜受體或抗原的分布,微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位；對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動態(tài)觀察可實時原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中的時空表達(dá)。
與傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡相比，多光子共聚焦顯微鏡具有更高的分辨率，實現(xiàn)多重?zé)晒獾耐瑫r觀察并可形成清晰的三維圖象等優(yōu)點。所以它問世以來在生物學(xué)的研究領(lǐng)域中得到了廣泛應(yīng)用。在對生物樣品的觀察中，多光子顯微鏡有其優(yōu)越性：對活細(xì)胞和組織或細(xì)胞切片進(jìn)行連續(xù)掃描，可獲得精細(xì)的細(xì)胞骨架、染色體、細(xì)胞器和細(xì)胞膜系統(tǒng)的三維圖像�？梢缘玫奖绕胀晒怙@微鏡更高對比度、高解析度圖象、同時具有高靈敏度、杰出樣品保護(hù)。多維圖象的獲得，如7 維圖象(XYZaλIt): xyt、xzt 和xt 掃描,時間序列掃描旋轉(zhuǎn)掃描、區(qū)域掃描、光譜掃描、同時方便進(jìn)行圖像處理。細(xì)胞內(nèi)離子熒光標(biāo)記，單標(biāo)記或多標(biāo)記，檢測細(xì)胞內(nèi)如PH和鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率測定及動態(tài)變化。熒光標(biāo)記探頭標(biāo)記的活細(xì)胞或切片標(biāo)本的活細(xì)胞生物物質(zhì)，膜標(biāo)記、免疫物質(zhì)、免疫反應(yīng)、受體或配體，核酸等觀察；可以在同一張樣品上進(jìn)行同時多重物質(zhì)標(biāo)記，同時觀察。對細(xì)胞檢測無損傷、精確、準(zhǔn)確、可靠和優(yōu)良重復(fù)性；數(shù)據(jù)圖像可及時輸出或長期儲存。
當(dāng)前，激光共聚焦顯微鏡較廣泛應(yīng)用的研究領(lǐng)域有：細(xì)胞生物學(xué)：如：細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞骨架、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、流動性、受體、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和分布變化、細(xì)胞凋亡機(jī)制；各種細(xì)胞器、結(jié)構(gòu)性蛋白、DNA、RNA、酶和受體分子等細(xì)胞特異性結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進(jìn)行定量分析；DNA、RNA含量、利用特定的抗體對紫外線引起的DNA損傷進(jìn)行觀察和定量；分析正常細(xì)胞和癌細(xì)胞骨架與核改變之間的關(guān)系；細(xì)胞黏附行為等。生物化學(xué)：如酶、核酸、受體分析、熒光原位雜交、雜色體基因定位等，利用共聚焦技術(shù)可以取代傳統(tǒng)的核酸印跡染交等技術(shù)，進(jìn)行基因的表達(dá)檢測，使基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯等檢測變的更加簡單、準(zhǔn)確。藥理學(xué)：如藥物對細(xì)胞的作用及其動力學(xué)；藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程、定位分布及定量。生理學(xué)、發(fā)育生物學(xué)：如膜受體、離子通道、離子含量、分布、動態(tài)；動物發(fā)育以及胚胎的形成，骨髓干細(xì)胞的分化行為；細(xì)胞膜電位的測量，熒光漂白恢復(fù)（FRAP）的測量等。遺傳學(xué)和組胚學(xué)：如細(xì)胞生長、分化、成熟變化、細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)、染色體分析、基因表達(dá)、基因診斷。神經(jīng)生物學(xué)：如神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、神經(jīng)遞質(zhì)的成分、運輸和傳遞。微生物學(xué)和寄生蟲學(xué)：如細(xì)菌、寄生蟲形態(tài)結(jié)構(gòu)。病理學(xué)及病理學(xué)臨床應(yīng)用：如活檢標(biāo)本的快速診斷、腫瘤診斷、自身免疫性疾病的診斷。免疫學(xué)、環(huán)境醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)：如免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三標(biāo)）的定位，細(xì)胞膜受體或抗原的分布,微絲、微管的分布、兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位；對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動態(tài)觀察可實時原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中的時空表達(dá)。
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徠卡電子顯微鏡 共聚焦顯微鏡 多光子顯微鏡
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