人外周血淋巴細胞RNA的提取方法

一、采集血樣，室溫保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管進行采血。一般使用EDTA或肝素抗凝均可；血量一般為1ml；一般地，1ml外周血中含有大約1-2*10^6個單個核細胞（PBMC，即淋巴細胞核單核細胞）。

二、提取淋巴細胞。取1.5ml 無菌無酶的離心管，為管1，先加入500ul淋巴細胞分離液；另一個1.5ml 無菌無酶的離心管中，裝有500ul血樣的真空管和500ul PBS（磷酸鹽緩沖液），1：1混勻的混合物，共1ml。然后緩慢把混勻的血樣PBS混合液加入到有淋巴細胞分離液的管1中，注意要緩慢，使血樣盡量位于提取液上層，不能太用力讓血細胞擴散到下層，就沒辦法離心分層了。（這一步的操作應該盡量快速的完成，因為時間長了，紅細胞就會在重力作用下沉降，混入到提取液中，對后面的離心造成影響）然后離心。1500rpm,15min,20攝氏度。

說明：

1、從采集血樣到開始實驗的時間最好不超過4小時。實驗過程中一直保持室溫條件，一般20攝氏度比較適中，因為細胞的最適溫度是體溫37攝氏度，但是溫度降低又可以降低細胞的代謝，兩者有些矛盾，所以取中間溫度比較理想。

2、關于淋巴細胞分離液的注意事項：啟封后應置4℃保存避免微生物的污染；分離液從冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液溫度升至室 溫時，搖勻后使用； 整個分離過程中，溫度應控制在18-28℃且在無菌環(huán)境下，避免微生物的污染，否則會影響分離質(zhì)量；未啟封前在18-25℃避光保存，啟封后置4℃保存， 本品為真空包裝，未啟封前置于10℃ 以下易出現(xiàn)白色結(jié)晶，影響分離效果。（各種淋巴細胞分離液的保存溫度不完全一致）
淋巴細胞分離液是一種根據(jù)細胞密度差異，借助離心產(chǎn)生的重力加速度，進行細胞的分離純化的常用試劑，為帶有乳光或微乳光的滅菌水溶液，主要成分是葡聚糖與 泛影酸葡甲胺。適用于人淋巴細胞和大多數(shù)哺乳動物細胞的分離純化，能除去紅細胞和死細胞碎片，所獲得的PBMC可進一步用于原代培養(yǎng)或流式細胞分析。最常用的細胞分離液有Ficoll和Percoll。

3、轉(zhuǎn)數(shù)為1500rpm，時間范圍為15分鐘，溫度為室溫20攝氏度。推薦兩步離心法：首先用1500rpm/min離心15min，如果白膜層足夠一步就結(jié)束，如果發(fā)覺細胞不夠，說明該病人的淋巴細胞比重較低，再重新用1500rpm /min離心15min。

三、離心后，分四層。淋巴細胞位于第二層（從上到下），呈白蒙蒙的一薄層。用移液器（200ul檔）吸取分離液層中的淋巴細胞，這里技巧性比較強，需要多 次練習才能比較熟練的把淋巴細胞吸的比較完全，大約可得到400ul的液體。把吸取的淋巴細胞溶液裝入另一無菌離心管中。加入1mlPBS緩沖液到離心管中，1500r,15min，20攝氏度。把離心后的上層液體倒掉，重復離心步驟至液體無明顯紅色（即紅細胞數(shù)量很少），淋巴細胞位于離心管底的一小點白色的物質(zhì)，一般會混有少量紅細胞，盡量避免。

說明：

1、洗滌后離心的條件，通常用1500rpm就足夠了，太高了容易把細胞離死。時間為15min，溫度還是室溫20攝氏度。

2、離心后，看到淋巴細胞中混有少量紅細胞，在這個實驗中問題不大。

3、洗滌液的選擇也是平衡鹽溶液即可，作用主要是去除淋巴細胞中的血漿蛋白和血小板，紅細胞很難去掉。一般洗滌液PBS用3ml即可。

四、用Trizol reagent 裂解淋巴細胞，提取RNA。在離心管中加入1ml Trizol試劑，可以裂解除RNA以外的其他大分子物質(zhì)，細胞膜，細胞器等。這個東西有致癌、致畸性，要帶口罩，小心操作。用加液槍吹打離心管底部的淋 巴細胞團塊，把其打散。一般至少吹打30-60次，主要目的是把其打散，讓Trizol試劑充分裂解淋巴細胞。把吹打之后的液體轉(zhuǎn)移到凍存管中，標記，浸泡進液氮（這一步的目的是快速凍存mRNA），一到兩小時以后，轉(zhuǎn)存在 -80攝氏度冰箱中。

五、外送

說明：

1、TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。

2、在TRIZOL中，RNA是隔離在RNA酶污染之外的。而對樣品的后續(xù)操作會要求用無RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器 皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小時。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分鐘，用水徹底漂洗干凈后高壓滅菌備用。當TRIZOL用量少于2-ml時建議使用清潔的一次性的聚丙材質(zhì)試管。

3、最后用于裝裂解細胞的凍存管請購買無菌無酶的凍存管。