美國國家癌癥研究所的研究人員在近日發(fā)表的有關(guān)Proton和HiSeq 平臺(tái)的對(duì)比研究顯示，在進(jìn)行外顯子組測序時(shí)，Life Technologies的Ion Proton和Illumina的HiSeq 2000在單核苷酸變異檢測方面均表現(xiàn)良好，但在準(zhǔn)確檢測插入缺失時(shí)存在某些問題。

該研究于本月初刊載在《人類遺傳學(xué)》上，很可能是首個(gè)發(fā)表的有關(guān)這兩個(gè)平臺(tái)性能對(duì)比的研究。該研究將采用Proton和HiSeq對(duì)HapMap CEPH三元家族生成的全外顯子組測序數(shù)據(jù)檢測到的變異進(jìn)行了比較。此外，還對(duì)從Complete Genomics公司獲得的全基因組測序數(shù)據(jù)的變異以及相同三元家族的Illumina SNP微陣列數(shù)據(jù)的變異進(jìn)行了對(duì)比。

美國國家癌癥研究所（NCI）癌癥基因組學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室的研發(fā)部主任和該研究的首席作者Joe Boland聲稱，本項(xiàng)目旨在評(píng)估其實(shí)驗(yàn)室能否將去年九月安裝的Ion Proton常規(guī)用于外顯子組測序，以作為HiSeq的可行替代方案。Joe Boland表示，“HiSeq是目前研究的黃金標(biāo)準(zhǔn)”。

“令人興奮的是，答案是肯定的，Proton的表現(xiàn)與HiSeqs旗鼓相當(dāng)”，Joe Boland告訴《In Sequence》�！拌b于我們?cè)赑GMs方面的經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于一個(gè)新平臺(tái)而言，我們希望它具有競爭力，但又不指望其像數(shù)據(jù)中所顯示的那樣卓越——因?yàn)樗�已�?jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了我們對(duì)它的期盼。”

Proton和HiSeq 平臺(tái)在單核苷酸變異檢測方面表現(xiàn)良好，但在插入缺失上卻存在差異，出現(xiàn)某些問題�！斑@兩個(gè)平臺(tái)在檢測插入缺失方面有利有弊。我認(rèn)為，如果您只需在[生成數(shù)據(jù)]后進(jìn)行仔細(xì)的搜集，則這兩個(gè)平臺(tái)足以滿足您的需求”， Boland說。

NCI實(shí)驗(yàn)室最近配置了六臺(tái)Ion Torrent PGM，四臺(tái)Ion Proton，一臺(tái)HiSeq 2000，一臺(tái)HiSeq 2500 ，以及一臺(tái)MiSeq。

開展研究后，研究人員于12月和1月生成了相關(guān)數(shù)據(jù)，并在2月的基因組生物學(xué)和技術(shù)進(jìn)步會(huì)議（IS 2/26/2013）上提交了初步結(jié)果。目前，該實(shí)驗(yàn)室根據(jù)機(jī)器的可用性以及生成結(jié)果的速度采用HiSeqs和 Protons進(jìn)行全外顯子組測序。 實(shí)驗(yàn)室的多個(gè)項(xiàng)目涉及家族性外顯子組研究，如果HiSeqs被預(yù)定完，則將轉(zhuǎn)為采用Proton進(jìn)行小型家族性外顯子組研究，Boland表示。 “由于這兩個(gè)平臺(tái)的質(zhì)量目前不相上下，如果我們從一個(gè)平臺(tái)轉(zhuǎn)向采用另一個(gè)平臺(tái)，這不會(huì)給我們的研究人員帶來任何困難”。 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室目前主要采用Protons開展轉(zhuǎn)錄組測序研究，Boland說。

實(shí)驗(yàn)室采用任一平臺(tái)進(jìn)行全外顯子組測序時(shí)，各樣本的費(fèi)用差額在$150以內(nèi)，Boland表示，“在確定運(yùn)行哪個(gè)平臺(tái)時(shí)，價(jià)格不是主要的考慮因素”。

為進(jìn)行對(duì)比，研究人員采用Ion Proton和HiSeq 2000對(duì)CEPH三元家族的外顯子組進(jìn)行了測序。為捕獲外顯子組數(shù)據(jù)，研究人員在采用Proton 時(shí)使用的是Life Tech的TargetSeq Exome v2，可包含50百萬堿基序列；而在采用Illumina時(shí)使用的是NimbleGen SeqCap EZ Exome v3，其能捕獲約64百萬堿基序列。 研究人員將其分析限制在43百萬堿基序列上，即兩個(gè)外顯子組捕獲試劑的重疊部分。

采用Proton進(jìn)行測序時(shí)，各樣本至少生成9千兆堿基數(shù)據(jù)，其中80%的讀數(shù)直指目標(biāo)。為檢測變異，通過Ion Reporter的標(biāo)準(zhǔn)管道運(yùn)行數(shù)據(jù)。

采用HiSeq進(jìn)行測序時(shí)，各樣本至少生成11千兆堿基數(shù)據(jù)，其中66%的讀數(shù)直指目標(biāo)。使用GATK管道檢測變異。

在共享外顯子組中，采用Proton時(shí)，各樣本平均檢測到了約28,000個(gè)變異，而采用Illumina時(shí)為34,000個(gè)——兩個(gè)平臺(tái)共享了約3/4的變異。

兩個(gè)平臺(tái)在進(jìn)行單核苷酸變異檢測時(shí)產(chǎn)生的結(jié)果大幅重疊，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了插入缺失的重疊部分。以代表樣本為例，兩個(gè)平臺(tái)都檢測出了約25,700個(gè)單核苷酸變異。 此外，僅Proton 檢測出了1,100個(gè)單核苷酸變異，而僅HiSeq檢測出了7,000個(gè)。

以相同樣本為例，這兩個(gè)平臺(tái)共同檢測出了約600個(gè)插入缺失，但是，Proton和HiSeq還分別檢測了另外的880個(gè)和920個(gè)插入缺失。研究人員在對(duì)特定平臺(tái)的插入缺失亞群進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，“由于比對(duì)問題及/或均聚物序列，很多插入缺失呈現(xiàn)出假陽性”。

研究人員還將通過Proton、HiSeq和Complete Genomics 檢測出的單核苷酸變異和插入缺失進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)這三個(gè)平臺(tái)檢測出了66%的（或23,700個(gè)）單核苷酸變異，但是僅檢測出了18%（總共530個(gè)）的插入缺失。

Proton檢測出了830個(gè)特定于該平臺(tái)的插入缺失；之后是Complete，為540個(gè)；最后是Illumina，為440個(gè)。科學(xué)家們得出結(jié)論，其分析“在檢測較小的插入缺失時(shí)，識(shí)別出了各方法存在的主要差異，這給進(jìn)一步提高技術(shù)測序及/或生物信息學(xué)算法提出了重大挑戰(zhàn)”。

在 將采用Proton 和HiSeq得出的SNP基因分型與三個(gè)三元樣本中的兩個(gè)的SNP微陣列數(shù)據(jù)進(jìn)行比較時(shí)，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)采用這兩個(gè)平臺(tái)，各樣本表現(xiàn)出很高的一致性，高達(dá)99%，表明SNP檢測具有較高質(zhì)量。

研究人員還通過檢測和分析讀數(shù)比對(duì)，更加密切地關(guān)注特定平臺(tái)變異的檢測情況。

很多Illumina平臺(tái)的特定單核苷酸變異為片段重復(fù)或簡單重復(fù)。 研究人員指出，根據(jù)Proton的數(shù)據(jù)，可以發(fā)現(xiàn)單拷貝區(qū)的單核苷酸變異具有較低的覆蓋率，因此Proton很可能遺漏了該等單核苷酸變異；但是Illumina的數(shù)據(jù)中也可能遺漏了SNP檢測，該等檢測在Proton的數(shù)據(jù)中“明顯且清晰”。

Boland說，其采用兩種不同的捕獲試劑的原因在于，在Proton平臺(tái)使用NimbleGen（羅氏）或Agilent（安捷倫）SureSelect捕獲試劑時(shí)尚無任何“商業(yè)許可”協(xié)議。“我們的想法是，采用任何批準(zhǔn)的東西，以便于人們從貨架上選擇產(chǎn)品并進(jìn)行使用”，Boland說。由于僅對(duì)重疊區(qū)域進(jìn)行了分析并僅使用了相同的DNA樣本，“在我們看來，這樣做是絕對(duì)有效的”。

在論文中，研究人員指出，較之HiSeq ，Proton的運(yùn)行時(shí)間 “明顯縮短”， 僅為11.5小時(shí)（包括數(shù)據(jù)處理的時(shí)間），而前者通常需要六天的運(yùn)行時(shí)間。

自從開展該項(xiàng)研究后，也對(duì)Proton進(jìn)行了改進(jìn)。據(jù)Mike Lelivelt—Ion Torrent的生物信息學(xué)和軟件產(chǎn)品主管說，由于提高了各芯片的輸出性能，目前，客戶可以采用各PI芯片同時(shí)對(duì)兩個(gè)（而非一個(gè)）外顯子組進(jìn)行測序。

Mike Lelivelt在研究中聲稱，公司“對(duì)Proton系統(tǒng)用于外顯子組測序的表現(xiàn)感到十分滿意”，這表明“盡管對(duì)于各平臺(tái)而言，進(jìn)行準(zhǔn)確的插入缺失檢測仍然任重道遠(yuǎn)”，但是，“該等平臺(tái)在單核苷酸變異檢測方面已經(jīng)遙遙領(lǐng)先”。Mike Lelivelt還指出，在所有變異中，插入缺失檢測的比例要遠(yuǎn)低于單核苷酸變異檢測。

Boland說，其小組目前正在開展其他的平臺(tái)比較，此類平臺(tái)關(guān)注于全轉(zhuǎn)錄組測序和擴(kuò)增子測序。該小組還對(duì)特定平臺(tái)的單核苷酸變異和插入缺失做了進(jìn)一步分析，以探明其他平臺(tái)遺漏該等單核苷酸變異和插入缺失的原因。 Boland計(jì)劃于秋季提交其研究的最初結(jié)果。