全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRFM）是一門非常復(fù)雜的光學(xué)技術(shù)，目前已經(jīng)被細(xì)胞生物學(xué)家和神經(jīng)科學(xué)家廣泛應(yīng)用，成為了細(xì)胞-基底接觸區(qū)域內(nèi)的豐富的細(xì)胞生命活動(dòng)最強(qiáng)有力的探測(cè)方法。如細(xì)胞膜內(nèi)蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)過程，基底附近的細(xì)胞骨架，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等。

TIRFM技術(shù)依賴于斜射光線在兩種不同折射率光學(xué)介質(zhì)表面產(chǎn)生的極淺的消逝波。該效應(yīng)產(chǎn)生的條件是入射介質(zhì)折射率大于折射介質(zhì)，并且斜射照射到光學(xué)界面時(shí)入射角大于全反射臨界角。

TIRFM分為棱鏡型和物鏡型。棱鏡型TIRF顯微鏡采用棱鏡產(chǎn)生衰逝波，并用物鏡收集熒光成像。但棱鏡型TIRFM需要在標(biāo)本上方安裝價(jià)格昂貴的棱鏡系統(tǒng)，而且安裝棱鏡還會(huì)使透射光觀察技術(shù)受限制，并會(huì)造成標(biāo)本振動(dòng)。而對(duì)物鏡型TIRFM而言，則可以克服以上缺點(diǎn)。物鏡型TIRFM的物鏡既作為收集樣品熒光信號(hào)的接受器，同時(shí)又作為發(fā)生全反射的光學(xué)器件。因此高數(shù)值孔徑的物鏡的使用是物鏡型全內(nèi)反射熒光成像系統(tǒng)的關(guān)鍵。

由于細(xì)胞的典型折射率為1.33~1.38，因此要實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射，在物鏡型全內(nèi)反射熒光成像系統(tǒng)中物鏡的數(shù)值孔徑（NA）必須大于1.38（NA=nsinθ; nsinθ>nsinθc ；n,θ 分別為物鏡的折射率和孔徑角；θc為發(fā)生全內(nèi)反射的臨界角）。當(dāng)物鏡數(shù)值孔徑為1.4時(shí)，只有很小的一部分?jǐn)?shù)值孔徑范圍（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可調(diào)節(jié)范圍（最大孔徑角與全內(nèi)反射角的差值）很小，光束校準(zhǔn)比較難，同時(shí)光束的強(qiáng)度也很難提高。若使用數(shù)值孔徑為1.65的物鏡，則有一個(gè)大的多的孔徑范圍（1.65-1.38=0.27）可以被利用，則入射角可調(diào)節(jié)范圍變大，降低了操作難度。

奧林巴斯提供的TIRFM物鏡，包括了數(shù)值孔徑1.69的最高分辨率的特殊物（APO100XOHR），這意味著TIRFM能夠在小于40納米深度實(shí)施觀察。100倍物鏡（UAPON 100xO TIRF）和60倍 物鏡（APON 60xO TIRF），其數(shù)值孔徑更是分別達(dá)到了1.65、1.49，其明場(chǎng)熒光顯微鏡的亮度比傳統(tǒng)100Xoil/1.4N.A. 物鏡提高了28%，分辨率也由0.240μm提高到0.203μm，為單分子影像觀察提供更明亮和更佳的對(duì)比度。此外150倍的高倍率高數(shù)值孔徑的物鏡(UAPON 150xO TIRF)適用于340nm紫外透射，可應(yīng)用在紫外激發(fā)熒光染料的TIRFM成像中。

Effect of the Apo100XOHR(N.A.: 1.65):

Single molecule fluorescence image of the Tetramethyl rhodamine