二、歷史背景
1． 固相合成法的誕生
    多肽合成研究已經走過了一百多年的光輝歷程。1902年，Emil Fischer首先開始關注多肽合成，由于當時在多肽合成方面的知識太少，進展也相當緩慢，直到1932年，Max Bergmann等人開始使用芐氧羰基(Z來保護α-氨基，多肽合成才開始有了一定的發(fā)展。
    到了20世紀50年代，有機化學家們合成了大量的生物活性多肽，包括催產素，胰島素等，同時在多肽合成方法以及氨基酸保護基上面也取得了不少成績，這為后來的固相合成方法的出現(xiàn)提供了實驗和理論基礎。
    1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，這個在多肽化學上具有里程碑意義的合成方法，一出現(xiàn)就由于其合成方便，迅速，成為多肽合成的首選方法，而且?guī)�來了多肽有機合成上的一次革命，并成為了一支獨立的學科——固相有機合成(SPOS)。因此，Merrifield榮獲了1984年的諾貝爾化學獎。Merrifield經過了反復的篩選，最終屏棄了芐氧羰基(Z)在固相上的使用，首先將叔丁氧羰基(BOC)用于保護α-氨基并在固相多肽合成上使用，同時，Merrifield在60年代末發(fā)明了第一臺多肽合成儀，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124個氨基酸)。
    1972年，Lou Carpino首先將9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保護α-氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除，10min就可以反應完全，而且由于其反應條件溫和，迅速得到廣泛使用，以BOC和FMOC這兩種方法為基礎的各種肽自動合成儀也相繼出現(xiàn)和發(fā)展，并仍在不斷得到改造和完善。同時，固相合成樹脂，多肽縮合試劑以及氨基酸保護基，包括合成環(huán)肽的氨基酸正交保護上也取得了豐碩的成果。

2． 多肽合成儀的誕生
    雖然Merrifield在發(fā)明固相多肽合成科學并取得巨大成功的同時，使用了自主研發(fā)的合成設備，但卻沒因此將多肽合成儀引入市場。1970年，Beckman公司開發(fā)的全自動多肽合成儀Beckman 990 Peptide Synthesizer 作為第一臺投入市場的科研用多肽合成儀，被美國多所大學的實驗室采用。
幾乎同一時間，Vega Biotechnologies, Inc.公司開發(fā)出兩款經濟型多肽合成儀：Vega’s Coupler 1000與Vega’s Coupler 250 (不久又推出Vega’s Coupler 296),其將多肽合成后續(xù)的在線切割理念結合到設備中，所有反應器采用防爆玻璃材質，防止TFA的腐蝕。被當時的肽化學界稱為最經濟適用的多肽合成儀。
    而今，Beckman與Vega’s兩家公司均停止的多肽合成儀的研發(fā)與制造，而轉向到更多面的化學合成、分離、檢測技術設備的研制產業(yè)中。

3． 多肽合成儀的發(fā)展
a) 第一代多肽合成儀
    第一代多肽合成儀是以Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer以及Vega’s Biotechnologies公司推出的Vega’s 296 Peptide Synthesizer為代表的，誕生在上世紀七十年代。
    雖然隨著生產工藝的改進和發(fā)展，如今第一代多肽合成儀已全部退出了市場。但1990年以前的眾多肽化學文獻都是在此實驗設備上運行研發(fā)而來，第一代的多肽合成儀為之后的合成儀研發(fā)與制造產生了重大意義。
b) 第二代多肽合成儀
    第二代多肽合成儀是以Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90為代表的，誕生在上世紀八十年代。此兩款設備也是目前市場上仍在銷售的最早的多肽合成儀。
    PS3 的設計原理是采用氮氣鼓泡的反應方式來對反應物進行攪拌，即合成儀上反應器是固定的，氮氣從反應器的下方通過反應器到上部排出，在這一過程中產生的汽泡把固相和液相混合起來。這樣設計的好處是結構簡單，成本低，但反應相對溫和：1）有時候多肽-固相載體在靜電作用下會“抱團”，使其不能與液相充分混合，在這種情況下需要調高氮氣的壓力以消除靜電作用；而在靜電作用消除后要把壓力立刻調低，不然的話較高的壓力會把多肽-固相載體“吹”到反應器液面上方。由于多肽-固相載體具有較強的粘壁性，一旦被粘到反應器液面上方就再也無法下來，也就是無法再參加反應。顯然第一代機器是無法自動作這樣的壓力調整的，這就是造成反應“死角”的重要原因。反應死角會降低多肽合成的效率和多肽的純度，有的甚至造成合成的失敗。2）長時間氮氣鼓泡會使溶液揮發(fā)，液面降低后一部分多肽-固相載體就粘在液面上方，也無法再參加反應。3）氮氣消耗量大，運行成本增大。
    ACT90的設計原理是反應器在直立下圍繞原點作左右擺動，或者圓周運動。ACT的多肽合成儀同樣具有反應溫和的特點，即轉動角度與速度都不能夠完全達到氨基酸耦合的極限，反應往往需要更長的時間。
c) 第三代多肽合成儀
    第三代多肽合成儀是以Applied Biosystems公司的ABI 433 peptide synthesizer 與C S Bio公司的CS336為代表的無死角多肽合成儀為代表的，誕生在上世紀九十年代。
    ABI433的設計原理是反應器上方相對固定，而下方作圓周360度快速旋轉，帶動反應器里的固液兩相從底部向上作螺旋運動，一直達到反應器的最上方。換句話說，溶液可以達到反應器內部的任意點，真正做到了無死角。由于攪拌速率可達每分鐘1800轉的高速，反應得以充分完全。由于無死角的攪拌方式保證的肽的合成純度，ABI433型多肽合成儀（其退出多肽合成儀市場后最后一款儀器）至今在世界上還占有著很大的比例。當然，ABI產品的售價也是最高的。由于部件使用頻率高，電磁閥會經常損壞，而ABI將7個電磁閥做成模塊化的設計，壞掉一個電磁閥必須要更換整個模塊，無形中增加了維修成本。
    CS336的設計原理是反應器中點為圓心，上下做180度旋轉攪拌，攪拌速度可達180rpm，同時其采用了氮氣鼓泡反應方式的優(yōu)越性，將氮氣吹動作為可選反應方式融入反應方法中，多肽合成儀在科研領域的高耦合率效果得到充分體現(xiàn)。

4． 多肽合成儀的現(xiàn)狀
    進入二十世紀以來，各大合成儀制造公司相繼推出了升級產品和新產品，如Protein Technologies公司推出Tribute雙通道多肽合成儀，將“短信通知”功能融入產品，增添了用戶與設備之間的緊密感，更加人性化；C S Bio公司對其從研發(fā)型到生產型設備的UV Online Monitor系統(tǒng)配置統(tǒng)一升級，用戶可直觀看到每一部氨基酸偶聯(lián)反應的狀態(tài)并可根據數(shù)據調整出最佳合成效果與工藝；Advanced ChemTech公司自2005年破產重組后分裂為兩家新公司，其中Aapptec延續(xù)了其前身的生產步驟，推出Focus XC三通道合成儀。美國另一家公司CEM以蛋白質有機反應設備的制造著稱，推出了微波多肽合成儀同樣可以合成簡單的小分子多肽。其采用微波加熱方式，大大提高了反應速度，將反應的速率增加到之前多肽合成儀的幾倍甚至十幾倍�？上У氖窃诩訜岬那闆r下副反應也相應增多，多肽純度不能與之前的第三代甚至第二代產品媲美。另外，微波加熱方法無法放大，故不適合用作多肽藥物的研發(fā)。

三、功能研究
1． 運行原理
    多肽合成儀以固相合成為反應原理，在密閉的防爆玻璃反應器中使氨基酸按照已知順序（序列，一般從C端-羧基端 向 N端-氨基端）不斷添加、反應、合成，操作最終得到多肽載體。固相合成法，大大的減輕了每步產品提純的難度。為了防止副反應的發(fā)生，參加反應的氨基酸的側鏈都是保護的。羧基端是游離的，并且在反應之前必須活化。固相合成方法有兩種，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多優(yōu)勢，現(xiàn)在大多采用Fmoc法合成，但對于某些短肽，tBoc因其產率高的優(yōu)勢仍然被很多企業(yè)所采用。
    具體合成由下列幾個循環(huán)組成： 1） 去保護：Fmoc保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine）去 除氨基的保護基團。 2） 激活和交聯(lián)：下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化。活化的單體與游離的氨基反應交聯(lián)，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反應完成。循環(huán)：這兩步反應反復循環(huán)直到合成完成。 3） 洗脫和脫保護：多肽從柱上洗脫下來，其保護基團被一種脫保護劑（TFA） 洗脫和脫保護。

2． 基本元件
a) 反應器 Reaction Vessel
    數(shù)百年來，制藥業(yè)的反應器/反應釜 設備以玻璃材質最為常見，因其完全透明且耐腐蝕，而被眾多化學、生物學專家沿用。多肽合成的過程需要操作人員直觀監(jiān)測，同時合成后可進行在線切割（切割試劑TFA的強腐蝕性對反應器材質有了極大限制），這些要求限制反應器以玻璃材質最為適用。
    而玻璃材質的反應器在制造工藝上有極大的難度限制：①燒制工藝：磨口精度要求極高，正如很多國產設備都無法達到要求出現(xiàn)漏液漏氣現(xiàn)象，玻璃壁均勻程度等。②配合攪拌柄以及密封裝置的成套加工工藝③防爆處理
b) 氨基酸儲罐 Amino Acid Reservoirs
c) 溶劑儲罐 Solvent Reservoirs
d) 量筒 Metering Vessel
e) 轉液瓶 Transfer Vessel
f) 感應器 Sensor
    多端觸發(fā)器自感應定量量取法，直觀、科學、相對誤差最低。
g) 廢液桶 Waste Carboy
    廢液桶通常選擇容積較大的HDPE桶，保證通風良好，同時需安裝感應器裝置時刻檢測廢液情況，避免溢出。

3． 控制配件
a) 電磁閥 Valves
    多肽合成儀中的電磁閥屬于敏感配件，其控制液路的串聯(lián)與閉路，在氨基酸轉移與量取，溶劑轉移與量取兩步驟中起到至關重要的作用。不同品牌的合成儀對電磁閥的設計與排布也略有不同。如PTI合成儀中，電磁閥成矩陣式排列，便于觀察，但若發(fā)生堵塞情況則又有維修的不便，一個電磁閥堵塞則可能造成整塊矩陣式電磁閥全部更換；CSBio合成儀中電磁閥采取Normally Close 方式，在非溶液轉移操作過程中，電磁閥閉合，減少了污染與堵塞的發(fā)生，整體呈管路式排布；ABI433合成儀的電磁閥為7位組合，萬一出現(xiàn)堵塞情況則整組更換，查找檢修時非常方便，但成本也相對高了6倍。
b) 控制面板 Control Box
    控制面板內往往含有光敏組建，部分控制電磁閥以及感應器控制組。與電腦主機的控制系統(tǒng)、合成儀統(tǒng)一的鏈接在一起，完成多肽合成的全過程。
c) 軟件系統(tǒng) Operating Software
    多肽合成儀的操作軟件。不同品牌合成儀所注冊的軟件也不同。

4． 檢測方法
a) UV Monitor
    在多肽合成儀中，在線檢測耦合效果的裝置，如UV Monitor往往是選配裝置，客戶可根據實驗的需要選購。其功能是讓操作者直觀的看到多肽合成的每一部氨基酸偶聯(lián)效果，從而針對特定的序列做合成設置的調整，最終達到最佳合成效果。
    對于不熟悉多肽合成儀操作的用戶來說，UV Monitor是相當重要的。
b) 試劑檢測：沒有選購在線檢測附件的多肽合成儀用戶，也可以采用試劑檢測方法做基本的耦合效果測定實驗。
    固相多肽合成中，主要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率，檢測方法稱為Kaiser方法，其檢測結果，如果有游離氨基的時候，顯示蘭色，或紅褐色（pro，ser，His）。
    Kaiser試劑包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液；B，80% 苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶液
    配制中的吡啶需要經過茚三酮處理后，重蒸后再使用。檢測過程，取少量樹脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加熱1-2min，如果溶液有蘭色，或樹脂出現(xiàn)蘭色，紅褐色，表明還有游離氨基，否則說明連接完全。
c) 其它檢測游離氨基的方法：三硝基苯磺酸法，苦味酸法，溴芬蘭法等

四、品牌介紹
1．國際主要多肽合成儀制造商
Applied Biosystems Inc. (ABI)
    美國應用生物系統(tǒng)公司是全球唯一的將個體識別應用相關的儀器試劑數(shù)據分析軟件進行整體設計和驗證的整體解決方案公司。自從1989年以來， AB公司已經發(fā)展成為DNA分析技術的“領頭羊”。其經典產品ABI433多肽合成系統(tǒng)在上世紀九十年代就暢銷全球，成為眾多多肽實驗室的首選設備，后繼CSBio公司推出的CS336與其功能與效果類似，統(tǒng)稱為第三代產品。

ABI 433型多肽合成系統(tǒng)

AAPPTec
    美國AAPPTec（advanced automated peptide protein technologies）公司成立于2005年3月，公司的前身是ACT（Advanced ChemTech）公司的儀器部。公司購買了前ACT公司儀器的全部資產，包括生產線，專利權以及在生產、促銷和服務等方面的獨家特權。由知名的多肽科學家，前ACT公司總裁Hossain Saneii博士管理，Hossain Saneii博士早在80年代早期就獲得了他的第一個多肽合成儀的專利。在過去的20多年，AAPPTEC的全自動多肽合成儀已經成為了市場上最靈活和可靠的儀器。可做Boc-,Fmoc-和其他化學方法，自動切割AAPPTec公司投入了充足的資源去提升和改進設備生產線，與此同時為藥學界和生物領域提供了眾多創(chuàng)新性新產品。其總部設在美國肯塔吉州的路易斯維爾。

AAPPTec 400 多肽合成儀

CS936X多肽合成儀

Protein Technologies Inc. (PTI)
    公司位于美國西部風景秀美的度假勝地圖森，是由美國亞利桑那大學幾名科研人員在1985年成立的。經過20多年創(chuàng)業(yè)歷程，PTI已經將其生產的科研型多肽合成儀銷售至全球多個高校。最早的PS3于1985年就設計出來了，而最新的一款帶有UV在線監(jiān)測功能的Tribute于2009年才上市，目前亞洲還沒有用戶反饋。

PTI Tribute Benchtop Peptide Synthesizer  

2. 國際其他固相有機合成設備及其供應商
Activotec
    Activotec公司推出的Activo-P14半自動多肽合成儀是目前世界最小的多肽合成儀。該儀器能夠自動完成多肽合成中繁瑣的樹脂清洗和去保護基步驟。用戶友好的觸摸式操作鍵盤界面每次都會自動提示操作者需要添加的氨基酸。

Activo-P14半自動多肽合成儀

Biotage
    瑞典公司Biotage推出的多肽合成系統(tǒng)，目前有三個型號可供選擇，不僅可以使用微波合成，也可以進行常溫的平行合成。系統(tǒng)采用全自動的電腦控制，并且配有單臂或者雙臂機械手。24位，48位和96位可選，反應器大小為2,5,10ml可選，合成規(guī)模在5μmol-300μmol之間，可以滿足不同用戶的需求。

Biotage 多肽合成儀

CEM
    美國CEM公司是全球知名的微波化學儀器生產商，其設在北卡羅萊納州的科研機構，集中了世界一流的微波化學專家，不斷研究和探索微波化學機理，開拓主頻2.45G-18GHz之間的微波技術科研應用，取得了大量的成果和專利，歷史上由CEM專家推出的各種微波樣品處理方法，被權威機構USEPA、AOAC、NCAT、ASTM等認可作為通用標準方法，如 USEPA3015/3051，UOP 方法等。其于后來推出的Liberty微波合成系統(tǒng)，同樣可以用于多肽的固相合成，在常溫下采取氮氣鼓泡方式會存在一定的反應死角，對于非敏感性的氨基酸，微波加熱方式可加快反應速率。

INTAVIS-AG 全自動多肽合成儀

Shimadzu（PSSM-8）
    日本島津公司早年推出的多肽合成裝置，可同時進行8道合成相同或不同的高純度多肽，實現(xiàn)日常的和經濟的多肽合成。

PSSM-8 多肽合成儀

ACT
    美國ACT公司（ADVANCED CHEMTECH），在2007年推出了106通道多肽合成儀，是全球唯一一款全自動多通道異步多肽合成儀，相比其它公司的多通道多肽合成儀，這款合成儀添加氨基酸和各種試劑不需要任何管路和電磁閥，儀器設計更加簡單合理，是目前多肽藥物研發(fā)篩選的主要合成儀之一。

3.二十世紀以來的國產多肽合成儀
JBP 海南建邦
    海南建邦制藥科技有限公司成立于2006年2月，是一家集制藥設備生產、科研、銷售一體的高技術企業(yè)，同時也是一家從事多肽藥物的新藥開發(fā)、生產工藝研究、生產廠房方案設計的專業(yè)化公司。海南建邦多肽合成儀秉承了國際通用的防爆玻璃反應器系統(tǒng)(tBoc與Fmoc方式均可操作)以及置頂攪拌槳的反應方式，但由于仿制美國CSBio合成儀受到專利保護限制，其部分功能配件不可正常使用。該品牌開創(chuàng)了國產合成儀的先河，然而設備加工稍顯簡陋，部分用戶使用幾個月后即發(fā)現(xiàn)通路堵塞、密閉性缺陷、整機震蕩等問題，在長久使用上還需進一步改進。

海南建邦多通道合成儀

PSI
    美國多肽科技有限公司（Peptide Scientific Inc .，簡稱PSI公司）是一家專業(yè)多肽合成儀生產廠商。PSI的多肽合成儀全部采用180-270度無死角的機械攪拌模式，PSI多肽合成儀與CS Bio多肽合成儀的180度相比有了質的突破，PSI合成儀攪拌系統(tǒng)采用電子伺服馬達，攪拌速度可調整到在0至120轉/分鐘之間的最符合實驗需要的轉速攪拌。

五、專利文件
    對于大學、實驗室等科研用戶以及需要申報新藥的生產企業(yè)來講，使用的合成設備的國際專利號以及規(guī)定內容是非常有用的信息。
1.ACT多肽合成儀專利：United States Patent 4746490
2.Activotec合成應用技術專利： IPC8 Class: AC07K104FI USPC Class: 525 5411
3.CEM合成技術專利：US 7,582,728
4.C S Bio多肽合成儀專利：US Patent 5,380,495 & 5,453,487.
5.C S Bio多肽合成儀反應器專利：US Patent 6320025
6.PTI多肽合成儀設備專利： U.S. Patent No. 5,203,368 (Symphony). No. 5,064,940(PS3).
7.PTI多肽合成儀反應器專利：U.S. Patent No. 5,980,839.
8.Shimadzu多肽合成儀專利：United States Patent 5344613

六、選購指南
1． 科研單位考慮因素
a) 設備本身對實驗研究的幫助
①對于多肽合成化學反應，使用設備可避免人手工操作對人體的傷害(試劑腐蝕)
②由于程序化設定，可保證每步驟偶合反應的充分性以及實驗整體的穩(wěn)定性
③可以合成難肽以及超長肽(可提供其使用研究型多肽合成儀合成多肽的檢測報告)
④在休息時間可以不間斷合成工作
    研究型多肽合成儀需滿足循環(huán)式氨基酸添加位置多于20個，在夜間以及周末，預先配好的保護氨基酸可根據程序設置自動偶聯(lián)并替換新的位置，保證了實驗的效率，完全實現(xiàn)全自動！
⑤即使實驗進行了很多年，更換了很多研究人員，實驗數(shù)據還可以保存在電腦中。
b) 國際國內相關研究人員使用該多肽合成儀進行的有效研究結果
    多肽合成儀的制造商應提供其公開發(fā)表的研究性論文多篇。 為進行多肽合成實驗的學生們提供研究數(shù)據并使其模擬合成過程，更好的體驗機械操作多肽合成的全步驟，檢測自己的合成結果。
c) 多肽合成儀設備的專利保護對今后研究結果的影響
    考慮到高等院校實驗研究的嚴密性，結合對后期研發(fā)成果的保護機制，通常采購的設備需要具有其國際專利許可，以確保實驗研究項目的順利申報。
d) 制造商的生產規(guī)模
    制造商的品牌、生產規(guī)模以及其所擁有的生產資格認證，都從側面反映了其供應設備的質量、信譽以及對客戶的服務保證。

2． 生產企業(yè)考慮因素
    參考科研單位選購小型設備的考慮因素，對于生產型企業(yè)，使用不同品牌的多肽合成儀往往還應考慮其連貫完整的設備生產線，從小型合成規(guī)模至生產型合成規(guī)模的各種設備齊全。通常大型設備可根據反應器大小判斷其合成規(guī)模，通�？稍诰�切割的玻璃材質反應器/反應釜需達100L，可保證批量產數(shù)十公斤的多肽產品。