正常成熟破骨細胞原代培養(yǎng)

實驗材料：

1. 細胞來源：新生大鼠或兔，妊娠6個月以內(nèi)的引產(chǎn)胎兒等；

2. 清洗液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素，pH7.2；

3. 細胞支持物：薄骨片、蓋玻片；

4. 培養(yǎng)液：199培養(yǎng)基、MEM或DMEM培養(yǎng)基均可，須補加15%—20%小牛血清、25mmol/L HEPES及青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml；

實驗方法：

1. 薄骨片的制備：取新鮮牛股骨干的密質(zhì)部分，沿骨縱軸用骨鋸切割成大小約0.5cm×0.5CM、厚為0.1cm的小塊，再用金剛砂輪磨成厚約10—50μm（以便在相差顯微鏡下觀察）的薄骨片。使用前用超聲波清洗儀超聲洗滌3次，每次約10min。然后依次浸泡在3個盛有含青霉素（1000IU/ml）、鏈霉素（1000μg/ml）、兩性霉素B（3μg/ml）的抗生素溶液的小容器中，每次10—20min。最后可浸于盛有含抗生素的培養(yǎng)液的容器內(nèi)，置4℃（短期）或-20℃（較長期）冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆茫?/SPAN>

2. 取生后3—5d的大鼠，拉頸處死后置于盛有75%酒精的容器中，消毒3—5min后，取出放入培養(yǎng)皿中；

3. 用手術(shù)剪剪開其四肢皮膚、肌肉，取股骨和脛骨等長骨，放入盛緩沖液的培養(yǎng)皿中。除去骨表面的軟組織、骨膜以及軟骨；

4. 將除去骨膜等多余組織后的長骨干部分清洗后，置于盛有少量培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。用手術(shù)刀或手術(shù)剪縱行剖開骨干。用手術(shù)刀輕刮骨的內(nèi)表面，同時用尖吸管不斷吸取培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，沖洗骨內(nèi)表面多次，直至骨內(nèi)表面變白為止；

5. 用吸管吸打上述含碎骨片及分離細胞的培養(yǎng)液2—5min左右，使附著于碎骨片上的破骨細胞分離脫落于培養(yǎng)液中。靜置1—2min后，待碎骨片沉降，收集細胞懸液；

6. 將細胞懸液加入到預(yù)置有薄骨片或蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

7. 培養(yǎng)30min左右，取出薄骨片或蓋玻片用培養(yǎng)液沖洗以除去未附著的骨髓造血細胞。沖洗后，將薄骨片或蓋玻片移入另一培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)；