1. 流感病毒的形態(tài)及實驗室分離純化：
引起人類流感的病毒是冠狀病毒。冠狀病毒只感染脊椎動物。
感染流感病毒后會引起人與動物的呼吸道、消化道與神經(jīng)系統(tǒng)病患。
流感病毒的代表型在上世紀 60年代被查明， 60年代后對各種流感病毒的完整形態(tài)已進行了深入研究。冠狀病毒的基因圖譜序列（包括各種蛋白酶和病毒內(nèi)部的核甘酸序列）已被查明。
流感致病病毒幾何尺寸：平均直徑 100～200nm沉降系數(shù)約為 700S~800S。
病毒（全病毒）在蔗糖液中浮密度約為 1.15～1.19g/ml
病毒形態(tài)：近似球形，中心部分核酸，最外部為纖突，是血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）的大分子，它附著在具有保護作用的脂質(zhì)膜上，纖突是病毒侵害人體細胞時附著道細胞上的吸附器，也是中和抗體的抗原。這二種表面抗原可以獨立或同時發(fā)生變異。 HA的變異性很強，是流感發(fā)生變異的主要原因。脂質(zhì)膜內(nèi)依次是膜蛋白、螺旋殼膜子粒、核酸鏈。
核酸：流感病毒的核酸為雙股線型 RNA，同種冠狀病毒的核酸序列是恒定的，但病毒發(fā)生變異后，核酸與蛋白的序列會發(fā)生某些微小變異。
病毒如何侵入人與動物細胞：纖突吸附到細胞膜上→病毒 RNA進入人體寄主細胞→病毒核酸復制→病毒蛋白合成（包括病毒殼膜及子粒），病毒的 RNA既可以直接作為 mRNA也可以轉(zhuǎn)錄形成一個互補的 RNA股。病毒進入寄主細胞后其信息通過人體細胞生物合成機制提供產(chǎn)能系統(tǒng)、核蛋白體、氨基酸活化酶、 tRNA和其他成分來指導合成一系列病毒蛋白。接著，病毒自身作為復制模板在特異聚合酶作用下復制，并用上述由病毒核酸指導合成的病毒蛋白集合成殼膜，組成一個新的病毒顆粒。
流感病毒由多個基因組片段分節(jié)段構(gòu)成，在感染細胞時，病毒基因組片段可發(fā)生重組。產(chǎn)生數(shù)百種遺傳學不同的重組子病毒亞型。這些重組病毒亞型具有父母代雙方的 RNA片段，而且多種不同的抗原變異株或重組子病毒可同時在脊椎動物中循環(huán)存在，在適應過程中通過基因重排，交換或功能互補使其致病力發(fā)生改變，從而導致新的流行病毒株的出現(xiàn)。
全病毒分離純化：培養(yǎng)液經(jīng)層析、超濾或高速連續(xù)流離心得到濃縮全病毒的上清液。小容量可用超速離心機，最高轉(zhuǎn)速為 40,000rpm的甩平轉(zhuǎn)頭，10～50％或類似蔗糖梯度作等密度離心 30,000rpm~35,000rpm，1～2小時，5℃。病毒應沉降在 30％～40％蔗糖梯度之間的某個位置形成純病毒區(qū)帶。用密度梯度儀（如日立 DGF-U）把管中液體自上而下用管道泵自動抽樣接至分光光度計流動池進行光密度連續(xù)檢測，經(jīng)部分收集器分部收集并給出從管上部液面到管底的容量——光密度曲線，從曲線的尖峰位置確定病毒所在的收集離心管編號（每個離心管分批收集成 50～100管）。經(jīng)透析及其他處理后得到純病毒濃縮液。
病毒裂介后純化處理：用 Triton X-100或乙醚裂介后高速離心濃縮抗原蛋白，然后用超速離心機作密度梯度離心純化。
中試和批量生產(chǎn)：根據(jù)生產(chǎn)規(guī)模可用低速大容量離心機或高速管式離心機或高速離心機高速連續(xù)流轉(zhuǎn)頭、大容量層析、超濾設(shè)備、超速區(qū)帶離心，超速連續(xù)流離心直至大容量超速連續(xù)流離心機作最后分離純化。

2. 流感疫苗的應用：
重要性：流感會引起區(qū)域甚至世界性大流行發(fā)病率和死亡率很高，對于兒童與老年人，發(fā)病率與死亡率更高。由于目前全世界各國老年人口增加比例高于其他年齡段，流感大范圍流行的后果將十分嚴重。目前唯一可行的預防措施是疫苗接種。流感全病毒滅活疫苗在全世界范圍內(nèi)使用已半個多世紀，50多年來由全病毒滅活疫苗→裂介的疫苗→亞單位疫苗已經(jīng)有了很大進步（高度純化、熱原成分極少、注射疫苗后負作用降低……）疫苗生產(chǎn)規(guī)程： 1968年，世界衛(wèi)生組織公布了第一個流感滅活疫苗生產(chǎn)規(guī)程。（WHO TRS-384） 1973年，對以上規(guī)程作了補充（WHO TRS-530）。 1979年，以后幾年又對疫苗血凝素含量的測定方法作了改進。，并進一步修訂了規(guī)程于 79年公布了新規(guī)程（WHO TRS-638）。此后 10多年中由于生產(chǎn)廠積累了豐富的經(jīng)驗，特別是連續(xù)傳代細胞系在疫苗生產(chǎn)上有了很大進展。WHO根據(jù)當時的實際情況又在 1989、1990、1991、1995年制定了新的流感疫苗生產(chǎn)和滅活規(guī)程。我國在 2004～2005年出版了以 95年 WHO規(guī)程為基礎(chǔ)的新規(guī)程。

3. 流感病毒的變異：
      流感病毒的流行病株多年來已發(fā)生多次變異，由于病毒毒株的變異。流感病毒（疫苗）和其他疫苗的不同之處在于毒種必須經(jīng)常改變以對付當年流行流感病毒。因此 WHO每年要發(fā)布當年疫苗中應包括的毒種的建議。近年來，導致流感的致病病毒的抗原蛋白（血凝素及其其他蛋白）的氨基酸序列以及三維結(jié)構(gòu)都已被測定（包括 2004年流行的 SARS病毒），已經(jīng)確定血凝素分子的改變可以造成抗原性質(zhì)改變并出現(xiàn)新的流行毒株。目前的科研水平還不能預測未來的變異情況，因為在抗原漂浮過程中發(fā)生的抗原變異株的選擇機制還不能認定。變異會有很多種進化途徑，對于未來出現(xiàn)新的血凝素亞型毒株（抗原變異）而造成新的流感爆發(fā)也是很難預測的。除了抗原變異和抗原漂移，研究還證實在流感病毒之間還存在另外一種類型的抗原變異：即在不同宿主細胞培養(yǎng)生長條件下可能會產(chǎn)生某些流感病毒的亞群。如在雞胚或鴨胚中生長的流感病毒與在傳代細胞 MDEK（狗腎）中分離和傳代培養(yǎng)的流感病毒相比，前者常會發(fā)生很小的抗原變異，對血凝素（蛋白）測序表明：在哺乳動物細胞中培養(yǎng)的流感病毒與在雞胚中培養(yǎng)的同株病毒相比，它們之間只存在單個氨基酸的替換。到目前為止造成流行的流感致病病毒，通常含有一種或多種 A（甲）型病毒，但是當 A（甲）型流感病毒出現(xiàn)一個新的亞型，即帶有新的血凝素和神經(jīng)氨基酸的抗原時，含有以往流行亞型的 A（甲）流感病毒抗原則變?yōu)闊o效。因此又必須使用含有新的流行毒株的抗原和疫苗。在世界性大流行的年代中已經(jīng)發(fā)現(xiàn) A（甲）型流感病毒的血凝素和神經(jīng)氨基酸抗原發(fā)生了連續(xù)不斷的抗原漂移，含有前一個流行毒株的疫苗對于后來的流感的防治效果較差。而 B（乙）型流感病毒毒株沒有發(fā)現(xiàn)亞型的變異，但有抗原變異，其變異程度比 A（甲）型病毒低得多。在多價疫苗中 B（乙）型流感病毒毒種的變化很小。因此流感疫苗中一般只含一種 B（乙）型流感毒株抗原。

4. 流感疫苗效力的測定：
      WHO規(guī)定：流感疫苗的效力以每 ml注射劑中所含有血凝素的μg數(shù)來決定。測定方法：免疫擴散試驗。確定參考抗原和抗血凝素的特異血清。參考標準由 WHO或國家生物制品標準和鑒定研究所及國家生物制品評審和研究中心制備和分發(fā)，當生產(chǎn)疫苗需要新毒株時，將隨時制備和提供新的參考抗原和抗血清。值得注意的是由于流感病毒的抗原變異，固定 A型和 B型病毒的抗原量是不合理的。對于不同的變異毒株，產(chǎn)生有效免疫的抗體水平所需的抗原是不一樣的。另外，疫苗接種對象的免疫應答程度取決于年齡，是否感染過與接種疫苗相關(guān)的血凝素和神經(jīng)氨基酸蛋白抗原的免疫經(jīng)歷、劑量、接種疫苗的類型（全病毒、裂介病毒抗原或純化表面抗原）。
5.  流感疫苗的生產(chǎn)：
I.  什么是流感疫苗：流感疫苗是無菌的滅活病毒懸液，由 A（甲）型或 B（乙）型流感病毒的一株或多株或二型混合液組成，病毒在雞胚中分別單獨培養(yǎng)。流感疫苗分為三種：
     用適當方法滅活的全病毒懸液；
     用物理化學方法部分或完全裂介處理病毒顆粒的無菌懸液（裂介疫苗）
     經(jīng)處理后主要由血凝素和神經(jīng)氨基酸抗原制成的無菌懸液（亞單位疫苗）
目前還可以通用具有表面抗原的高密度繁殖培養(yǎng)的重組病毒株生產(chǎn)的流感疫苗。
II.  血凝素參考品：當流感在某地區(qū)或世界可能將或已經(jīng)開始流行時，WHO將流行的新病毒株列入疫苗生產(chǎn)范圍并立即發(fā)放每 ml中含有標定的μg數(shù)的流行流感病毒的血凝素，由國家有關(guān)部門分發(fā)給各個流感疫苗的生產(chǎn)廠和檢定研究所實驗室，用免疫擴散法測定產(chǎn)品的血凝素抗原，并和標定抗原進行比較和鑒定。
III.  疫苗生產(chǎn) 嚴格按照 WHO及國家有關(guān)部門規(guī)定進行生產(chǎn)廠的檢察及內(nèi)部裝修設(shè)計，特別注意區(qū)域隔離、滅菌消毒、設(shè)備有效性、生產(chǎn)人員的安全保證等等。
嚴格控制生產(chǎn)原材料：只有經(jīng)過國家監(jiān)控部門批準的毒株方可用于生產(chǎn)。滅活流感疫苗用的病毒株必須有經(jīng)鑒證的記錄（原始株及后續(xù)處理資料；用于高產(chǎn)表達表面抗原的重組株病毒在培養(yǎng)過程中可能發(fā)生抗原變異，因此必須用血凝素單克隆抗體試驗或動物免疫血清血凝抑制試驗證明無此抗原變異。
種子批：疫苗生產(chǎn)只能用工作種子批，工作種子批只能傳一代，種子批病毒必須確認不含外源性活微生物（如用雞胚制備的種子批必須確認無雞白血病病毒和腺病毒）。液態(tài)種子批儲存在－60℃以下，凍干品保存在－20℃以下。
病毒繁殖：用于生產(chǎn)流感滅活疫苗的流感病毒用雞胚培養(yǎng)，雞蛋應來自健康雞群并經(jīng)國家有關(guān)部門批準。用工作種子批病毒對每個雞胚尿囊腔注射 0.2ml， 33℃～37℃培養(yǎng) 3天。培養(yǎng)后只能收獲雞胚尿囊液和羊水，不允許在任何過程中使用含有β－丙酰胺的抗生素（允許使用其他微量適宜的抗生素）如果疫苗用裂介病毒制成，裂介條件、使用的化學試劑品種及濃度必須經(jīng)國家批準。
滅活：單價病毒合并液在制成后應盡快滅活，滅活前保存于 5℃±3℃不超過 5天。在滅活前應檢查有無細菌或霉菌污染。滅活方法經(jīng)國家批準且必須能殺滅雞白血病病毒和支原體�！救缡褂酶�爾馬林（40％甲醛）或β－丙烯內(nèi)脂，濃度不能超過 0.1％】。滅菌后病毒合并液儲存于 5℃±3℃。
濃縮和純化：一般用超速離心法（超速區(qū)帶離心或超速連續(xù)流離心）可以在滅菌前或滅菌后進行。濃縮或純化過程中應最大程度地保護血凝素和神經(jīng)氨酸酶抗原。
產(chǎn)品鑒定：要進行表面抗原濃度測定、抗原鑒別試驗、滅菌試驗、總蛋白量測定（蛋白含量不得超過血凝素含量 6倍，但在任何情況下，一個人份劑量的一個毒種蛋白量不超過 100μg，一個人份總蛋白量不超過 300μg）、卵白蛋白測定（一個人份劑量卵白蛋白含量不得超過 5μg，可以低于 1μg）、血凝素測定（一個人份劑量中血凝素含量為 7～20μg，按標簽上的血凝素含量，實際含量應在 80％至 120％之間；還要用鱟試劑做內(nèi)毒素測定。
附件：
一些有關(guān)的術(shù)語：
母種子批：（Master seed lot）:從 WHO推薦的一株病毒在同一時間內(nèi)培養(yǎng)得到的一定數(shù)量的同一成分的病毒。母種子批用于制備工作種子批。毒種母種子批及其傳代代數(shù)均由國家有關(guān)部門批準。
工作種子批:（Working seed lot）:由毒種母種子批培養(yǎng)所得到的一定數(shù)量的病毒為同一成分病毒，經(jīng)過全面鑒定。病毒傳代代數(shù)不得超過國家檢定當局批準的最長代數(shù)，工作種子批用于疫苗生產(chǎn)。
單一收獲物：（Single harvest）:用同一毒株同時接種并同時收獲的一定數(shù)量的病毒液。
單價病毒合并液：用同一病毒株在同一時間生產(chǎn)的一定數(shù)量的單一收獲液的合并液。
半成品：（Final bulk）:將一批或數(shù)批單價病毒合并液置于一容器中并由此分裝到疫苗瓶中。半成品可以含有一個或數(shù)個病毒株。
成品批：一批已分裝并封口的疫苗瓶，在分裝過程中受污染的危險性是相等的。因此，成品批必須是由一批半成品在同一工作程序中分裝的疫苗。