【摘要】
目的：探討ATP發(fā)光技術(shù)快速檢測(cè)菌落總數(shù)的可行性。方法比較ATP生物發(fā)光值與平板計(jì)數(shù)法對(duì)細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果：檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性研究分析表明，兩者在一定范圍內(nèi)具有顯著相關(guān)性。
結(jié)論：ATP生物發(fā)光法操作簡(jiǎn)便，應(yīng)用范圍廣，可應(yīng)用于對(duì)食品中菌落總數(shù)的快速檢測(cè)。

 

 

菌落總數(shù)是食品微生物國(guó)標(biāo)檢測(cè)中的一個(gè)重要指標(biāo)，主要是作為判定食品被細(xì)菌污染程度的標(biāo)志。在國(guó)家頒發(fā)的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)口貿(mào)易中許多食品的衛(wèi)生指標(biāo)都有菌落總數(shù)的限量規(guī)定。常規(guī)的菌落總數(shù)檢驗(yàn)方法(平板計(jì)數(shù)法)存在操作繁瑣、測(cè)試周期較長(zhǎng)及檢測(cè)結(jié)果在實(shí)際生產(chǎn)的質(zhì)量控制中意義不大等問(wèn)題。ATP生物發(fā)光測(cè)定法是快速檢測(cè)微生物的方法之一。本文對(duì)ATP生物發(fā)光測(cè)定法與平板計(jì)數(shù)法的相關(guān)性進(jìn)行了研究分析，并對(duì)ATP生物發(fā)光測(cè)定法進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)檢測(cè)的可行性和可操作性進(jìn)行探討。

 

1．1儀器與試劑
ATP生物發(fā)光快速檢測(cè)系統(tǒng)配套儀器及試劑(沈陽(yáng)中科靚馬生物工程有限公司生產(chǎn))，包括：濱松9505微量光度計(jì)、專(zhuān)用比色杯、發(fā)光反應(yīng)試劑(LLR)、細(xì)菌細(xì)胞ATP釋放試劑(XRA)。旋渦混合器。稀釋用磷酸鹽緩沖液(PBS)9ml試管分裝10管(121℃高溫高壓滅菌)。固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(121℃高溫高壓滅菌)。PE手套。大腸桿菌(ATCC25922—3，購(gòu)于中國(guó)藥品與生物制品檢定所)。恒溫?fù)u床。臺(tái)式離心機(jī)。

 

1．2．1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
計(jì)數(shù)前1天，用接種環(huán)刮取大腸桿菌斜面培養(yǎng)物一環(huán)接種到裝有40mlLB的100ml三角瓶?jī)?nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取上述培養(yǎng)物離心(10000r／min，1min)倒去上清液，沉淀用等體積PBS洗滌1次，用同樣體積PBS懸浮，此即培養(yǎng)物原液。稀釋?zhuān)?假定培養(yǎng)物濃度約為1×10⁶ cell／m1)用PBS將培養(yǎng)物做10倍遞增稀釋。

 

1．2．2平板計(jì)數(shù)
確定3個(gè)用于平皿計(jì)數(shù)的稀釋梯度，保證至少1個(gè)梯度的計(jì)數(shù)在30～300范圍內(nèi)，吸取1ml加人到玻璃滅菌空培養(yǎng)皿中，每個(gè)梯度平行倒兩個(gè)平板，同時(shí)做空白對(duì)照。于37℃溫箱培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)。選擇菌落計(jì)數(shù)在30～300范圍內(nèi)均勻分散的釋梯度作平板計(jì)數(shù)并取其平均值。

 

1．2．3 ATP測(cè)光
提前打開(kāi)微量光度計(jì)屏幕顯示RLU為“0”，用滅菌的移液管尖吸取50待測(cè)菌液，加入專(zhuān)用比色杯中。將比色杯放人微量光度計(jì)抽屜，手持XRA試劑瓶，向比色杯底垂直滴加兩滿滴XRA。用滅菌的100µl移液管尖，將50µl LLR加入杯中，和緩地吸擠3次，混勻反應(yīng)液。保持抽吸時(shí)間、次數(shù)一致。并力求所有樣品的這段操作時(shí)間一致。關(guān)上微量光度計(jì)抽屜，此時(shí)微量光度計(jì)自動(dòng)進(jìn)行熒光值測(cè)量，等微量光度計(jì)顯示出熒光值后記錄熒光值的大小。

 

2．1 ATP測(cè)定法與平板計(jì)數(shù)法試驗(yàn)結(jié)果
兩種方法測(cè)定細(xì)菌總數(shù)的兩次平行試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1、表2。

2．2 ATP測(cè)定法與平板計(jì)數(shù)法相關(guān)性
依據(jù)表1、表2數(shù)據(jù)，以光值平均數(shù)的對(duì)數(shù)值為Y軸，平板計(jì)數(shù)平均數(shù)對(duì)數(shù)值為x軸，作x、Y散點(diǎn)圖描繪關(guān)系曲線，Y=0.8834x—1.6807，R²=0．9778。從數(shù)據(jù)和散點(diǎn)可以看出，第一次試驗(yàn)的1O一、第二次試驗(yàn)的10^-5、10 ^-6 3個(gè)梯度的值與其他值線性較差，在檢測(cè)限以外�？梢钥闯觯�在細(xì)菌數(shù)量10 cfu／ml以上范圍內(nèi)平板計(jì)數(shù)與生物發(fā)光值成顯著相關(guān)。

 

ATP生物發(fā)光法檢測(cè)靈敏度高，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)受試液顏色、操作及非細(xì)菌ATP對(duì)發(fā)光強(qiáng)度均有影響，但對(duì)總體發(fā)光強(qiáng)度的影響都<0．9％。從待測(cè)樣品的制備到細(xì)菌ATP的提取，直到ATP發(fā)光強(qiáng)度的檢測(cè)，整個(gè)過(guò)程可在lh內(nèi)完成，具有快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，可以滿足一般快速檢測(cè)的要求。ATP發(fā)光技術(shù)能達(dá)到的檢測(cè)極限為l0^-15 molATP，相應(yīng)的細(xì)菌總數(shù)應(yīng)在10³ cfu／ml以上，樣品衛(wèi)生指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)在10³ cfu／ml以上的可即時(shí)得出樣品細(xì)菌總數(shù)數(shù)量判斷質(zhì)量好壞。而微生物檢驗(yàn)衛(wèi)生指標(biāo)在10³ cfu／ml以下，可采用適當(dāng)簡(jiǎn)便的富集技術(shù)，使樣品菌落總數(shù)達(dá)到有效檢測(cè)范圍，而該技術(shù)也是ATP發(fā)光技術(shù)能應(yīng)用于衛(wèi)生檢驗(yàn)的關(guān)鍵。近年來(lái)，蟲(chóng)熒光素酶已通過(guò)基因工程生產(chǎn)，價(jià)格大幅度減低，隨著相關(guān)儀器的小型化，ATP生物發(fā)光技術(shù)必將會(huì)在國(guó)內(nèi)相關(guān)行業(yè)得到迅速普及。

（馬妮 趙虹 中國(guó)衛(wèi)生工程學(xué)）