微陣列—比較基因組雜交技術(shù)檢測染色體異常

【摘要】近年微陣列一比較基因組雜交(microarraycomparativegenomichybirdization，microarray．CGH)技術(shù)被應(yīng)用到臨床細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域。該技術(shù)是選擇DNA特殊片段作為靶，固化在載體上，形成密集、有序的分子微陣列。然后，從測試標(biāo)本中提取DNA，將測試DNA和參考DNA用不同的熒光色素標(biāo)記，雜交到微陣列上，通過檢測這兩種熒光色素的比率，了解待測標(biāo)本基因拷貝數(shù)的變化。其能夠檢測染色體亞微結(jié)構(gòu)異常。微陣列技術(shù)已成為一個重要的工具，用于產(chǎn)前、產(chǎn)后和植人前診斷染色體亞微結(jié)構(gòu)異常。

 

在過去30年中，染色體核型分析是診斷染色體病的標(biāo)準(zhǔn)方法。近年來，微陣列一比較基因組雜交(microarraycomparativegenomichybridization，microarray—CGH)技術(shù)用于染色體病研究中．該技術(shù)又稱為“分子核型分析”�？蓪θ旧�體亞微結(jié)構(gòu)異常進行診斷．本文主要介紹microarray—CGH技術(shù)在細(xì)胞遺傳學(xué)方面的應(yīng)用。microarray—CGH技術(shù)簡介

一、技術(shù)原理與發(fā)展

microarray—CGH技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)，雖然與傳統(tǒng)的比較基因組雜交(CGH)技術(shù)基于相同的原理，但傳統(tǒng)的CGH是選擇中期分裂相作為靶．而microarray．CGH是選擇DNA特殊片段作為靶，固化在載體上，形成密集、有序的分子微陣列。因為DNA的特殊片段作靶，可以根據(jù)DNA片段大小及密度決定解析度。microarray—CGH可檢測到那些不能為傳統(tǒng)方法檢測到的微重復(fù)和缺失。為與傳統(tǒng)的核型分析相比較，這種全染色體組陣列檢測稱為“分子核型分析”。最初．microarray—CGH引入腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)研究領(lǐng)域，是因為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)困難，所獲得中期分裂相形態(tài)欠佳．而且腫瘤細(xì)胞染色體改變復(fù)雜，用

傳統(tǒng)染色體分析方法很難監(jiān)測到遺傳物質(zhì)微小缺失和重復(fù)。應(yīng)用全基因組的microarray—CGH研究大量的腫瘤標(biāo)本，可以繪出常發(fā)生基因拷貝數(shù)改變的區(qū)域。而用高密度的microarray—CGH能對這些區(qū)域基因拷貝數(shù)改變進行詳細(xì)的分析[。依照基因拷貝數(shù)變化的類型和數(shù)目可對腫瘤進行分型，鑒別引起腫瘤發(fā)生發(fā)展的基因[。而最近該技術(shù)已用于臨

床細(xì)胞遺傳學(xué)，檢測有臨床表現(xiàn)的染色體微缺失和微重復(fù)綜合征Es-9]。

與傳統(tǒng)的核型相比，分子核型顯示很多的優(yōu)越性。但microarray—CGH并不能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的染色體分析，因為，其不能檢測染色體的平衡易位及多倍體。microarray—CGH是通過檢測患者和對照組的基因拷貝數(shù)的變化來發(fā)現(xiàn)異常的。在平衡易位沒有基因拷貝數(shù)的變化，因此，不能檢測平衡易位。另外，microarray—CGH是通過檢測熒光強度的比率來鑒別異常，而來自三倍體的雙倍染料的熒光強度最終認(rèn)為是正常的，所以也不能檢測多倍體。

近年來．microarray—CGH開始用于臨床細(xì)胞遺傳學(xué)的研究，現(xiàn)將研究結(jié)果從3個方面進行綜述。檢測流產(chǎn)絨毛染色體目前，臨床上用絨毛組織制備染色體診斷流產(chǎn)胚胎是否有染色體異常。通常絨毛細(xì)胞培養(yǎng)方面存在一些問題。包括：高發(fā)培養(yǎng)失敗，母親細(xì)胞過度生長，染色體形態(tài)不佳等。因此，盡管胎兒染色體有異常。有時也難以發(fā)現(xiàn)。Schaeffer等2004年首次發(fā)表用microarray-CGH技術(shù)檢查流產(chǎn)胚胎的染色體。在這項研究中，選擇的DNA．a(chǎn)rray包括每條染色體的末端端粒，所有微小缺失綜合征DNA特殊片段。還另外選擇一些特

殊位點DNA片段。分析41個流產(chǎn)胚胎，microarray—CGH不僅檢測到染色體G帶分析發(fā)現(xiàn)的所有異常，而且還查到4例染色體亞微結(jié)構(gòu)異常。隨后Shimokawa等m]也發(fā)表類似的報道，在20例常規(guī)染色體分析顯示正常核型的流產(chǎn)絨毛標(biāo)本中，用microarray—CGH分析發(fā)現(xiàn)其中1例有3號染色體短臂微缺失。Benkhalifa等和Fritz等[]的研究顯示，microarray—CGH具有檢測在培養(yǎng)中未增殖細(xì)胞的染色體異常的能力。因此。其可檢測到常規(guī)染色體分析不能發(fā)現(xiàn)的染色體異常。

microarray—CGH不僅能檢測染色體亞微結(jié)構(gòu)異常，由于其使用標(biāo)本中提取的DNA進行檢測．microarray—CGH還能解決絨毛細(xì)胞培養(yǎng)失敗所引起的問題。如果將microarray．CGH應(yīng)用到流產(chǎn)胚胎的染色體的檢查中，將能更快、更精確地得到診斷結(jié)果。檢測多發(fā)畸形兒。智力低下兒染色體異常近年來，microarray—CGH技術(shù)也應(yīng)用到多發(fā)畸形兒，智力低下兒病因?qū)W調(diào)查中。LeCaignec等用商業(yè)化array試劑盒(包括所有染色體的末端，主要的染色體微缺失綜合征及201個覆蓋全染色體組的區(qū)域)檢測49例有3個以上畸形但染色體核型正常的患兒，發(fā)現(xiàn)8個亞微結(jié)構(gòu)的異常，包括末端和內(nèi)部的缺失。亞微結(jié)構(gòu)重復(fù)以及復(fù)雜的基因不平衡。4例基因型和表型之間有明顯的聯(lián)系。6q末端微缺失在1例母親和其2個多發(fā)畸形嬰兒中都監(jiān)測到，這使得基因型和表型之間的關(guān)系不清。另外，3例監(jiān)測到10q的微重復(fù)．這可能是一種遺傳多態(tài)。其結(jié)果顯示，microarray—CGH除能檢測到染色體的亞顯微結(jié)構(gòu)異常外．還能發(fā)現(xiàn)一些基因的遺傳多態(tài)。

Schoumans等[]用microarray．CGH檢測一組不明原因智力低下患兒。這4l例患兒都有不明原因的智力低下和多發(fā)畸形，常規(guī)染色體檢查未發(fā)現(xiàn)異常。30例曾進行多末端位點的原位熒光雜交(lfuorescentinsituhybridsation，F(xiàn)ISH)篩查，11例曾進行光譜核型分析(spectralkaryotyping，Sky)均未發(fā)現(xiàn)異常。應(yīng)用商業(yè)化的試劑盒(2600BAC的克隆，以1Mb的間距分散在整個染色體組)對這4l例患兒進行檢測。發(fā)現(xiàn)4例有染色體亞顯微結(jié)構(gòu)異常，該異常的基因片段長度范圍在1～14Mb之間。Nowakowska等[]進一步證實microarray—CGH

技術(shù)在監(jiān)測染色體亞微結(jié)構(gòu)異常方面的作用。用染色體微陣列分析(chromosomalmicroarrayanalysis．CMA)技術(shù)對9l例智力低下但染色體核型正常患兒進行分析，發(fā)現(xiàn)19例(20．8％)患兒有基因拷貝數(shù)變化，其中11例(11．8％)基因拷貝數(shù)變化與臨床表現(xiàn)有關(guān)，認(rèn)為6例(6．5％)是遺傳多態(tài)。2例(2．1％)基因拷貝數(shù)的變化意義不明，異常基因片段長度在0．5～12．9Mb之間。最近，Tsuchiya等用microarray—CGH技術(shù)對

4例帶有額外標(biāo)記小染色體的患者進行研究發(fā)現(xiàn)．額外小染色體的結(jié)構(gòu)比預(yù)想的結(jié)構(gòu)要復(fù)雜得多，其他分子細(xì)胞遺傳學(xué)方法無法對其進行詳細(xì)解析。microarray．CGH技術(shù)在細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用將有助于對額外小染色體的解析及更進一步了解其與表型的關(guān)系。

染色體核型分析應(yīng)用于產(chǎn)前診斷有三十多年的歷史，一直認(rèn)為是標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)前診斷方法。雖然核型分析法可準(zhǔn)確地鑒別非整倍體和大的染色體結(jié)構(gòu)異常，但這種技術(shù)在解析度方面有明顯的限制。另一個缺點是由于羊水中活細(xì)胞很少，在核型分析前，必須進行1～2周細(xì)胞培養(yǎng)�；颊叩却�結(jié)果時間長。高危妊娠需要一種快速的檢測方法。而microarray．CGH技術(shù)能克服這些缺點。如果microarray—CGH能夠用于未培養(yǎng)的細(xì)胞．可大大縮短患者等待結(jié)果的時間。為此目標(biāo)，Larrabee等用從羊水中提取的游離DNA進行microarray—CGH分析。研究中首先調(diào)查11例男性胎兒羊水中游離DNA，與女性胎兒DNA相比較，在SRY基因有明顯增強的陽性信號和減少的x染色體特殊位點信號。然后又調(diào)查3例21一三體的胎兒，與二倍體比較，在21一三體特殊位點信號明顯增加；另外還調(diào)查1例x單體的胎兒，在大多數(shù)x染色體的特殊位點信號明顯減少。結(jié)果顯示，從羊水中抽取游離的DNA，用microarray—CGH分析，能正確診斷胎兒的性別和染色體數(shù)目異常。而且這種技術(shù)將有可能成為對胎兒全染色體組進行篩查的方法。

microarray—CGH在監(jiān)測染色體亞微結(jié)構(gòu)異常的同時，也能檢測到遺傳多態(tài)，因此，將其應(yīng)用到產(chǎn)前診斷中應(yīng)慎重考慮其解析度和構(gòu)成。如果用解析度很高的array．可能檢測到一些與臨床表現(xiàn)無關(guān)的基因拷貝數(shù)變化。選擇1種低密度的array，覆蓋全基因組，平均解析度是10Mb，但在一些區(qū)域增加密度，以便檢測微小缺失和微小重復(fù)綜合征和亞末端的缺失。Rickman]用這種方法調(diào)查30份產(chǎn)前和產(chǎn)后的標(biāo)本，除了1例三倍體以外，檢測到這組標(biāo)

本中曾被核型分析及FISH法檢測的所有異常。另外，與1Mb的array相比較，證實檢測率有改進。最近．Shaffer等[加]用microarray．CGH技術(shù)在151份產(chǎn)前標(biāo)本中檢測到1．3％的患兒有染色體異常：而在1375例新生兒中11．4％的患兒有染色體異常。認(rèn)為造成檢測比率的差異是由于40％的新生兒是因為有畸形才進行microaray—CGH檢測的。而超聲及產(chǎn)前篩查不能發(fā)現(xiàn)這些異常。如果將microaray—CGH應(yīng)用到產(chǎn)前篩查，那么。在產(chǎn)前診斷

中就會發(fā)現(xiàn)更多的異常胎兒。

 

microaray—CGH技術(shù)的特點，使一些染色體亞微結(jié)構(gòu)異常兒在宮內(nèi)得到診斷。同時，用DNA進行檢測不需要細(xì)胞培養(yǎng)，可快速得到診斷結(jié)果。因此該技術(shù)在未來的產(chǎn)前診斷領(lǐng)域中有廣泛的應(yīng)用前景。

microarray．CGH技術(shù)特點使其能檢測染色體的亞微結(jié)構(gòu)異常．而且，有可能實現(xiàn)快速和自動檢測標(biāo)本。在細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域?qū)⑵鸬街匾�的作用。使目前條件下無法檢測的由于染色體亞微結(jié)構(gòu)異常造成的疾病得到診斷。同時，可大大減少檢驗花費的時間和人力。在很大程度上將代替染色體核型分析法。由于不能檢測染色體的平衡易位和多倍體，因此．傳統(tǒng)的染色體檢查法也將繼續(xù)保留在染色體病的診斷中。