為了便于對所檢測樣本進(jìn)行比較，在real-timeQ-PCR反應(yīng)的指數(shù)期，首先需設(shè)定一定熒光信號的域值，一般這個域值（threshold）是以PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號（baseline），熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。如果檢測到熒光信號超過域值被認(rèn)為是真正的信號，它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)（Ct）。Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。研究表明，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

 

病原體檢測：
目前，采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、肝炎病毒、結(jié)核桿菌、細(xì)小病毒B19、EB病毒和人巨細(xì)胞病毒等病原體進(jìn)行定量測定。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優(yōu)點。

遺傳及優(yōu)生優(yōu)育診斷：
到目前為止，人們對遺傳性物質(zhì)改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產(chǎn)前監(jiān)測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。例外還可以通過實時熒光定量PCR對孕婦弓形蟲，梅毒等檢測，這對找出不明原因流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)的病因提供有力的幫助，大大提高優(yōu)生優(yōu)育。

指導(dǎo)治療：
對病原體定量分析顯示：病原體量與某些藥物的療效關(guān)系。如HCV高水平表達(dá)，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異等。

腫瘤基因檢測：
盡管腫瘤發(fā)病的機理尚未清楚，但相關(guān)基因發(fā)生突變是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被廣泛接受。p53癌基因的表達(dá)增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現(xiàn)。實時熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準(zhǔn)確檢測癌基因的表達(dá)量。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因的不斷發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR技術(shù)將會在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。

免疫方面檢測：
通過熒光定量PCR檢測出B27，HLA等來幫助診斷免疫性疾病，如強直性脊柱炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、器官移植排異反應(yīng)等。

實時熒光定量PCR技術(shù)在藥物研究方面的應(yīng)用：

新藥開發(fā)研究，
人用藥物及其他藥物：針對一些感染性疾病的藥物，如各種病毒病、細(xì)菌病等，在新藥的開發(fā)過程中，快速了解藥物對疾病進(jìn)程的影響可以為新藥開發(fā)節(jié)約大量的人力、時間和資金，與以前所用的Elisa等方法相比，實時熒光定量PCR技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確、定量、靈敏地測定血液或組織中病原體的含量，因此有利用分析藥物的作用效果，為比較不同的配方的療效、用藥量、用藥時間等等提供快速、定量的評價。

超早期感染用藥物及療法的研究與開發(fā)：
實時熒光定量PCR方法測定是血液中病毒核酸的含量，因此不必等到病人體內(nèi)產(chǎn)生抗體，同時，由于其靈敏度與Elisa相比不可同日而語，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低時就可以測定。因此就出現(xiàn)了一個新的領(lǐng)域，即在病毒或細(xì)菌含量很低時如何用藥，用什么藥以及用藥量等進(jìn)行研究，為將疾病消滅在超早期作出貢獻(xiàn)。

藥物療效研究：
對于一些已經(jīng)上市的新藥或是應(yīng)用了很長時間的老藥，其用藥的效果以及用藥量及用藥時間都可以進(jìn)行進(jìn)一步的研究，為更加合理化的應(yīng)用這些藥物為人類造福進(jìn)行進(jìn)一步的研究。以前所用的方法由于不能準(zhǔn)確定量，靈敏度也不夠，因此有很多需要研究的內(nèi)容沒有完成。這一方面需要研究內(nèi)容很多，意義也很大。

新的愈后指標(biāo)的研究：
對于感染性疾病，在藥物作用至一定程度后，就認(rèn)為可以停藥了，但是應(yīng)該在什么停藥，現(xiàn)在大都沒有一個明確的指標(biāo)，現(xiàn)在所用的指標(biāo)由于受到檢測方法的靈敏度及準(zhǔn)確性限制，這一指標(biāo)未必合理，因此有必要對治愈的指標(biāo)以及指標(biāo)與復(fù)發(fā)率以及疾病轉(zhuǎn)化為其他疾病之間的關(guān)系等進(jìn)行進(jìn)一步的研究，從而為藥物或療法徹底治愈疾病打下堅實的理論基礎(chǔ)。

新診斷及檢驗試劑的開發(fā)：
現(xiàn)有的很多診斷及檢驗方法都不能同時滿足快速、靈敏、定量的要求如現(xiàn)有培養(yǎng)法、Elisa法等等，而熒光定量PCR方法以則可以做到這一點，從而可為臨床疾病、商檢、糧油檢驗、食品檢驗、血液檢驗等等開發(fā)新的試劑，從而提高檢驗的靈敏度、速度及準(zhǔn)確性等；這類試劑的種類是非常多的，所開發(fā)的試劑的社會效益及經(jīng)濟效益都是很巨大的。

2009年4月，全球性的人感染豬流感公共衛(wèi)生事件發(fā)展勢頭迅猛，發(fā)生國家眾多，世界衛(wèi)生組織29日晚已將全球流感大流行警告級別從4級提高到5級，我國也于28日召開了國務(wù)院常務(wù)會議對防控進(jìn)行了部署�，F(xiàn)在已進(jìn)入關(guān)鍵的防控措施落實階段，其中檢測與診斷技術(shù)至關(guān)重要。

人感染豬流感疫情發(fā)生后，美國疾病預(yù)防控制中心（CDC）于2009年4月28日發(fā)布了針對人感染豬流感病毒治療和預(yù)防臨時指南，其中規(guī)定了確診病例的診斷方法：具有急性發(fā)燒呼吸道疾病的臨床癥狀并且經(jīng)實時熒光定量PCR(real-timeRT-PCR)或病毒分離培養(yǎng)(viralculture)實驗室檢測方法檢驗證實感染A（H1N1）型豬流感病毒。