農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用-高分辨熔解曲線分析技術(shù)
高分辨熔解曲線分析技術(shù)（High Resolution Melting Curves Analysis）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種檢測(cè)基因突變和刷選SNP的新方法。這種方法也可以與標(biāo)記和非標(biāo)記探針結(jié)合對(duì)已知位點(diǎn)的突變和SNP進(jìn)行檢測(cè)以及用于SSR（STR）等短串聯(lián)重復(fù)分子標(biāo)記分析。
該技術(shù)已經(jīng)被大規(guī)模應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，用來(lái)分析和篩選導(dǎo)致人類疾病的基因的突變研究。一系列的研究證明，高分辨熔解曲線分析技術(shù)是篩選SNP和進(jìn)行基因分型工作的迅速、廉價(jià)而有效的方法。
目前，高分辨熔解曲線分析技術(shù)開始越來(lái)越多的被應(yīng)用在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究中，并且取得不少成績(jī)。其中比較有代表性的研究單位有英國(guó)洛桑農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站、中國(guó)科學(xué)院發(fā)育與遺傳研究所、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所、中國(guó)林業(yè)研究院熱帶林業(yè)研究所等。
下面，簡(jiǎn)單介紹一下高分辨熔解曲線在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
小麥?zhǔn)鞘澜缟掀毡榉N植的糧食作物，對(duì)人類的可持續(xù)發(fā)展有重要的影響。英國(guó)環(huán)境、食品和農(nóng)業(yè)事務(wù)部小麥遺傳改良工作組(Defra Wheat Genetic Improvement Network)與英國(guó)洛桑農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站合作建立了采用高分辨熔解曲線進(jìn)行基因突變分析的研究平臺(tái)。研究者采用化學(xué)誘變劑甲磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate，EMS)對(duì)春小麥進(jìn)行誘變，然后采用高分辨熔解曲線分析的方法(LightScanner™ 系統(tǒng)和LCGreen Plus染料)對(duì)處理后的樣品進(jìn)行掃描，證明這種方法在研究小片段的基因靶序列時(shí)有很高的靈敏度與成功率，并且在研究那些外顯子較小而內(nèi)含子很大的基因時(shí)特別有效。
下圖為采用LightScanner系統(tǒng)和LCGreen染料對(duì)EMS誘變后的春小麥進(jìn)行的高分辨熔解曲線分析。
圖1. GA20ox1D中的高分辨熔解曲線進(jìn)行的突變掃描。野生型的小擴(kuò)增片段為灰色，可能的突變體用紅色顯示。
大麥輕性花葉病毒（BaMMV）和大麥黃色花葉病毒（BaYMV）可以導(dǎo)致大麥的黃花葉病，嚴(yán)重影響大麥的產(chǎn)量。隱形等位基因rym4和rym5對(duì)BaMMV和BaYMV有抗性，在歐洲被用在大麥的育種工作中。英國(guó)洛桑農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站最近發(fā)現(xiàn)rym4和rym5以及rym6與真核轉(zhuǎn)錄起始因子4E（eIF4E）的突變等位基因相當(dāng)。對(duì)植物的eIF4E基因及其亞型eIF(iso)4E的研究有助于了解抗病機(jī)制。洛桑農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站的研究者們?cè)谑澜绶秶鷥?nèi)收集大麥主要種植地的大麥樣品，采用基于cDNA的高分辨熔解曲線分析的方法(cDNA-based high-resolution melting）對(duì)其中1100個(gè)樣品的eIF4E基因進(jìn)行突變篩查。英國(guó)洛桑農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站采用這種高通量低成本的研究方法掃描了eIF4E基因編碼序列的突變位點(diǎn)，對(duì)含有突變的基因進(jìn)行了測(cè)序，成功的鑒定出了大于30個(gè)不同的eIF4E等位基因的突變，大大節(jié)省了測(cè)序工作的成本和精力。
下圖為英國(guó)洛桑農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)站采用LightScanner儀器對(duì)不同樣品中eIF4E基因的高分辨熔解曲線的分析結(jié)果。其中，藍(lán)色和紅色的曲線所代表的樣品均為突變型，灰色的為野生型樣品。
圖2. 采用高分辨熔解曲線(LightScanner™ system; Idaho Technology Inc.)對(duì)eIF4E的突變等位基因進(jìn)行篩選。
多倍體植物因其基因的多拷貝，一個(gè)等位基因上隱性突變所造成的影響常被其他同源拷貝所彌補(bǔ)；另外，多拷貝基因也常常給測(cè)序工作帶來(lái)麻煩，這些原因使得研究多倍體作物更為困難。采用混合樣品的高分辨熔解曲線分析的方法常常對(duì)突變檢測(cè)和基因型研究有意想不到的效果�；驹硎峭粋�(gè)SNP位置上兩個(gè)不同的純和突變子通過(guò)混合會(huì)產(chǎn)生一個(gè)類似雜合子的熔解曲線。如果是兩個(gè)相同的基因型的樣品，則混合后產(chǎn)生的熔解曲線不會(huì)發(fā)生變化。中科院遺傳所的中科院某實(shí)驗(yàn)室采用該方法對(duì)小麥親本的基因型進(jìn)行分析。中科院某實(shí)驗(yàn)室將兩個(gè)親本中的任意一株的熔解曲線與子一代的熔解曲線進(jìn)行比較，如果兩條熔解曲線相同則證明兩株親本樣品的基因型一樣。如果不同，則證明兩株親本樣品基因型不同。這種方法快速而有效的幫助中科院某實(shí)驗(yàn)室解決了如何確定親本的基因型是否相同的問(wèn)題。
下圖為中科院某實(shí)驗(yàn)室采用LightScanner系統(tǒng)對(duì)已知的親本樣品和子一代的熔解曲線進(jìn)行的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
圖3-A不同基因型的親本和子一代的熔解曲線。紅色的曲線和灰色的曲線代表的樣品被LightScanner認(rèn)為是野生型和突變。
圖3-B 相同基因型的親本和子一代的熔解曲線。親本和子一代被LightScanner認(rèn)為均屬野生型樣本。
圖3-A中的兩個(gè)親本樣品的基因型是不同的。將子一代與親本樣品的PCR產(chǎn)物在LightScanner系統(tǒng)上進(jìn)行高分辨熔解曲線分析，被LightScanner系統(tǒng)認(rèn)為是野生型和突變型，表明兩個(gè)親本的基因型不同。圖3-B中的兩個(gè)親本樣品的基因型相同，將子一代與親本樣品的PCR產(chǎn)物在LightScanner系統(tǒng)上進(jìn)行高分辨熔解曲線分析，被LightScanner系統(tǒng)認(rèn)為均是野生型，表明兩個(gè)親本的基因型相同。該方法在研究多倍體細(xì)胞時(shí)，可以快速簡(jiǎn)便的鑒定樣品的基因型是否相同。
隨著測(cè)序技術(shù)與生物信息技術(shù)的發(fā)展，各種模式生物的基因組信息越來(lái)越完善，其他物種的基因組也在不斷的被測(cè)序。但是，可以想象，地球上的生物種類如此豐富，不可能對(duì)每個(gè)物種的基因組都進(jìn)行測(cè)序。因此，在研究那些基因組信息不全的物種時(shí)就會(huì)給研究帶來(lái)不少麻煩。澳大利亞新英格蘭大學(xué)采用高分辨熔解曲線與EST數(shù)據(jù)庫(kù)相結(jié)合的方法來(lái)研究整個(gè)杏樹基因組中的SNPs。他們從NCBI Genebank中的EST數(shù)據(jù)庫(kù)中得到3864 條杏樹的EST序列，同時(shí)結(jié)合杏樹和桃樹的SNP數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)篩選潛在的SNP。然后通過(guò)高分辨熔解曲線分析的方法對(duì)25個(gè)杏樹變種中推測(cè)的SNP進(jìn)行篩選與驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)杏樹中SNP的發(fā)生頻率為1：114bp，轉(zhuǎn)換與顛換的比例為1.16：1；同時(shí)證明高分辨熔解曲線分析方法是篩選SNP和進(jìn)行基因分型工作的快速有效且成本低廉的研究方法，并且特別適合于研究基因組信息很少的生物。
下圖為澳大利亞的研究者對(duì)兩個(gè)不同的小的擴(kuò)增片段進(jìn)行的高分辨熔解曲線的分析。
圖4. 高分辨熔解曲線對(duì)兩個(gè)含有SNP位點(diǎn)的Xneas280a和Xneas109a小擴(kuò)增片段進(jìn)行的分析。其中，a為Xneas280a的熔解曲線圖，b是對(duì)圖a做的差異圖，c為Xneas109a的熔解曲線圖，d是對(duì)圖c做的差異圖。
高分辨熔解曲線分析技術(shù)自從開發(fā)出來(lái)后，因其迅速，廉價(jià)和高通量等特點(diǎn)而被迅速的應(yīng)用到了醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域的研究中。越來(lái)越多的研究證明，該技術(shù)同樣適用于農(nóng)業(yè)領(lǐng)域關(guān)于SNP篩選，基因分型和品種鑒定等方向的研究。隨著對(duì)作物研究的不斷深入，該技術(shù)也必會(huì)被更廣泛的應(yīng)用在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究中。
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