454技術(shù) 樣品制備 

        將基因組打成較短的DNA片段，再將片段與接頭相連，以便使其更容易與磁珠結(jié)合在一起（一個(gè)DNA片段結(jié)合于一個(gè)磁珠）。將PCR產(chǎn)物包被于“油包水”的乳化劑中，每一滴乳化劑內(nèi)除PCR產(chǎn)物外，還含有一個(gè)結(jié)合了一個(gè)DNA片段的磁珠，這樣，PCR擴(kuò)增過(guò)程就可以在每一滴乳化劑內(nèi)獨(dú)立進(jìn)行，而沒(méi)有其它競(jìng)爭(zhēng)性或者污染性序列的影響。如此，使整個(gè)DNA片段進(jìn)行平行擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)完成后，每個(gè)磁珠上的DNA片段擁有了成千上萬(wàn)個(gè)相同的拷貝。經(jīng)過(guò)富集以后，這些片段仍然和磁珠結(jié)合在一起，隨后就可以放入到PicoTiterPlate板（一種光纖載板）的樣品孔內(nèi)供后繼測(cè)序使用了。

焦磷酸測(cè)序（Pyrosequencing）

        在光纖PicoTiterPlate板樣品孔內(nèi)還有測(cè)序過(guò)程所需的酶類(lèi)及引物（引物與DNA片段末端的接頭序列互補(bǔ)），當(dāng)未經(jīng)熒光標(biāo)記的核苷酸流經(jīng)過(guò)樣品孔時(shí)，每次只允許一個(gè)互補(bǔ)dNTP接入，進(jìn)行互補(bǔ)新鏈的合成。每當(dāng)一個(gè)核苷酸連接到新鏈上時(shí)，就會(huì)釋放一分子的焦磷酸鹽（PPi），而后PPi與相應(yīng)底物反應(yīng)形成1分子ATP，ATP再驅(qū)動(dòng)熒光素酶轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸療晒馑孛�，而氧化熒光素酶可以發(fā)出可見(jiàn)光，可被檢測(cè)儀器捕獲，形成峰圖。該技術(shù)的序列閱讀長(zhǎng)度介于100到150個(gè)核苷酸之間。（具體原理見(jiàn)文后擴(kuò)展閱讀）

圖片來(lái)源：Katie Ris-Vicari

Solexa測(cè)序技術(shù)  樣品制備 

        將基因組DNA打成幾百個(gè)堿基（或更短）的小片斷，在片斷的兩個(gè)末端加上接頭，利用專(zhuān)利的芯片:其芯片表面連接有一層單鏈引物，DNA片斷成單鏈后通過(guò)芯片表面的引物堿基互補(bǔ)被一端“固定”在芯片上，引物擴(kuò)增使得單鏈DNA成為雙鏈，該雙鏈變性后成為單鏈，其一端“固定”在芯片上，另外一端（5'或3'）隨機(jī)和附近的另外一個(gè)引物互補(bǔ)，被“固定”住，形成“橋”。這樣的反應(yīng)在上千萬(wàn)DNA單分子上發(fā)生，形成的單鏈橋以周?chē)�的引物為擴(kuò)增引物，在芯片表面進(jìn)行擴(kuò)增，形成雙鏈。雙鏈經(jīng)變性成單鏈，再次形成橋，成為下一輪擴(kuò)增的模板繼續(xù)擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)30輪擴(kuò)增，每個(gè)單分子得到了1000倍擴(kuò)增，成為單克隆“DNA簇群”�！癉NA簇群”在Genome Analyzer 綜合分析儀上進(jìn)行序列分析 。（參考http://www.emtd.com.cn/product/Solexa1.htm）

采用“可逆性末端終止反應(yīng)”進(jìn)行序列分析(圖片來(lái)源：Katie Ris-Vicari)

        序列合成反應(yīng)體系包括有引物、DNA聚合酶、4種標(biāo)記了不同熒光的核苷酸，每個(gè)核苷酸的堿基被保護(hù)基團(tuán)封閉。每次反應(yīng)摻入一個(gè)核苷酸，該核苷酸類(lèi)別可通過(guò)標(biāo)記熒光進(jìn)行識(shí)別，經(jīng)過(guò)掃描，讀取該次反應(yīng)顏色后，位于堿基3'末端的保護(hù)基團(tuán)被除去，繼續(xù)下一輪反應(yīng)，如此反復(fù)，得出片段的精確序列。該技術(shù)讀長(zhǎng)為30–35個(gè)核苷酸。

SOLiD技術(shù) 樣品制備 

        DNA經(jīng)物理方法處理成幾百堿基左右的片段，兩端與接頭相連接，與Adaptor相連的DNA片段和固定有與接頭序列互補(bǔ)序列的磁珠混合后，進(jìn)行Emulsion PCR。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將變性DNA單鏈與磁珠移至載玻片上。

連接法測(cè)序

        測(cè)序引物與接頭可以互補(bǔ)雜交，其5’端可與和鄰近序列互補(bǔ)的寡核苷酸相連。八聚體寡核苷酸可競(jìng)爭(zhēng)性與引物相連接（該寡聚體的第四位和第五位為熒光標(biāo)記位點(diǎn)）。當(dāng)其標(biāo)記顏色被讀取后，即將連接上的寡核苷酸在第五位和第六位之間切斷，以移除標(biāo)記，進(jìn)行下一輪反應(yīng)，依此循環(huán)。在第一輪反應(yīng)中，可以得到確定的堿基位點(diǎn)為：4、5、9、10、14、15位堿基等。重復(fù)該反應(yīng)過(guò)程，偏移一位堿基，使用較第一輪少一個(gè)堿基的引物進(jìn)行反應(yīng)，可以確定的堿基位點(diǎn)包括：3、4、8、9、13、14等，如此往復(fù)，直至偏移至引物的第一個(gè)堿基（即待測(cè)序列0位點(diǎn)堿基）。由于該位點(diǎn)堿基已知，可通過(guò)讀取的熒光顏色得知位點(diǎn)1的堿基類(lèi)型，然后，又以位點(diǎn)1堿基熒光顏色推知位點(diǎn)2的堿基類(lèi)型，依此類(lèi)推，直至整個(gè)序列讀序完成。此技術(shù)目前的讀長(zhǎng)為30至35個(gè)堿基。

連接法測(cè)序示意圖（圖片來(lái)源：Katie Ris-Vicari）

原文檢索：Nature Methods - 5, 15 (2008) Published online: 19 December 2007; |doi:10.1038/nmeth1155

擴(kuò)展閱讀：http://bio.biox.cn/protocols/200706/20070625234254_26254.shtml