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實(shí)時(shí)熒光定量PCR簡(jiǎn)介

瀏覽次數(shù):5842 發(fā)布日期:2008-12-14  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)從誕生到現(xiàn)在已經(jīng)有 8 年了,但是其應(yīng)用在近四年才迅猛增長(zhǎng)。在 Medline 數(shù)據(jù)庫(kù)中,用“ Taqman” 或 ”real time PCR” 作為關(guān)鍵詞檢索,在1996 年僅有 19 篇,在 1997 年僅有 28 篇,在 98 、 99 、2000 年分別達(dá)到了 52 、 157 、 409 篇, 2003 年已經(jīng)達(dá)到2984 篇,相信在不久的將來(lái)會(huì)有更多的文章發(fā)表。針對(duì)實(shí)時(shí) PCR 這一熱點(diǎn)領(lǐng)域,閃晶公司對(duì)它進(jìn)行了深入細(xì)致的研究,并且及時(shí)地為廣大科研人員推出這項(xiàng)技術(shù)服務(wù)。

熒光定量PCR基本原理 

•  Taqman 技術(shù):該技術(shù)以美國(guó) ABI 公司為代表。 PCR 擴(kuò)增時(shí),在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針。該探針為一直線(xiàn)型的寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)和一個(gè)熒光淬滅基團(tuán),探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收, PCR 儀檢測(cè)不到熒光信號(hào); PCR 擴(kuò)增時(shí)(在延伸階段), Taq 酶的 5' - 3' 外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條 DNA 鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與 PCR 產(chǎn)物形成完全同步,這也是定量的基礎(chǔ)所在。 

•  Beacon 技術(shù):該技術(shù)以美國(guó)人 Tagyi 為代表。也是加入了熒光探針,但它是 環(huán)狀的寡核苷酸探針,分別由莖部和環(huán)部組成, 兩端分別標(biāo)記 熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光猝滅基團(tuán),在無(wú)靶序列的情況下,探針始終是環(huán)狀,報(bào)告基團(tuán)的熒光被猝滅基團(tuán)猝滅,使熒光檢測(cè)儀檢測(cè)不到熒光信號(hào);而在有靶序列時(shí),即在 PCR 的退火階段探針與靶序列結(jié)合,使熒光報(bào)告基團(tuán)和猝滅基團(tuán)分開(kāi),這樣熒光儀可以檢測(cè)到熒光,熒光信號(hào)的強(qiáng)弱代表了靶序列的多少。 



•  FRET 技術(shù):該技術(shù)以 Roche( 羅氏公司 ) 為代表。它的基本原理是:兩條直線(xiàn)型寡核苷酸探針,其中一條的 3 ‘端標(biāo)記熒光激發(fā)基團(tuán),另一條的 5 ' 端標(biāo)記熒光檢測(cè)基團(tuán),在無(wú)靶序列的情況下,兩條探針?lè)珠_(kāi),無(wú)法進(jìn)行能量的傳遞,這樣熒光儀不能檢測(cè)到熒光信號(hào);而當(dāng)有靶序列時(shí),即在 PCR 的退火階段兩條探針與靶序列結(jié)合,使得兩條探針上的熒光基團(tuán)可以進(jìn)行能量的傳遞,這樣熒光儀就可以檢測(cè)到熒光信號(hào),熒光信號(hào)的強(qiáng)弱代表了靶序列的多少。

•  Ct 值:是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(如下圖所示)。

•  熒光域值( threshold ):是指 PCR 反應(yīng)的前 15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào),熒光域值的缺省設(shè)置是 3-15 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍,即:threshold。 

•  Ct 值與起始模板的關(guān)系:研究表明,每個(gè)模板的 Ct 值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線(xiàn)性關(guān)系〔 1 〕,起始拷貝數(shù)越多, Ct 值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù),縱坐標(biāo)代 Ct 值(如圖 2 所示)。
因此,只要獲得未知樣品的 Ct 值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

熒光定量PCR應(yīng)用廣泛 

•  可以對(duì)各種基因的表達(dá)進(jìn)行定量分析,如:同一基因在不同組織中的表達(dá)差異、同一基因在不同藥物處理后的表達(dá)差異、轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)。過(guò)去最常用的高通量篩選基因表達(dá)差異的技術(shù)是 cDNA 芯片和差異顯示,但這兩種技術(shù)的缺點(diǎn)是只能定性而非完整意義上的定量分析。實(shí)時(shí) PCR 技術(shù)和高通道實(shí)時(shí) PCR 儀的出現(xiàn),無(wú)疑為這種檢測(cè)提供了極大的方便。 

•  可以進(jìn)行點(diǎn)突變分析和等位基因分析,用不同的熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記 Taqman 探針,然后分別與野生型和突變型雜交,如果一種熒光信號(hào)明顯強(qiáng)于另一種熒光信號(hào),則表明它是純合子;如果兩種熒光信號(hào)都明顯增強(qiáng),則表明它是雜合子。另外分子信標(biāo)( Molecular Beacon )就是專(zhuān)門(mén)為這種技術(shù)設(shè)計(jì)的探針。 

•  可以進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的分析,檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性對(duì)于研究個(gè)體對(duì)不同疾病的易感性或者個(gè)體對(duì)特定藥物的不同反應(yīng)有著重要的意義,因分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)的巧妙性,一旦 SNP 的序列信息是已知的,采用這種技術(shù)進(jìn)行高通量的 SNP 檢測(cè)將會(huì)變得簡(jiǎn)單而準(zhǔn)確。 

•  可以進(jìn)行 DNA 甲基化檢測(cè), DNA 甲基化同人類(lèi)的許多疾病有關(guān),特別是癌癥, Laird 報(bào)道了一種稱(chēng)作 Methylight 的技術(shù),在擴(kuò)增之前先處理 DNA ,使得未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不受影響,用特異性的引物和 Taqman 探針來(lái)區(qū)分甲基化和非甲基化的 DNA ,這種方法不僅方便而且靈敏度更高。 

•  對(duì)傳染性疾病進(jìn)行定量定性分析,這在我國(guó)應(yīng)用比較廣泛,大家比較熟悉。許多生產(chǎn)臨床 PCR 試劑的廠(chǎng)商已經(jīng)陸續(xù)推出了一系列的診斷試劑,如:肝炎系列、性病系列、腫瘤系列等等。


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