實(shí)驗(yàn)?zāi)康?BR>掌握凝膠層析的基本原理。
學(xué)習(xí)利用凝膠層析法測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)技能。
實(shí)驗(yàn)原理
凝膠層析法也稱(chēng)分子篩層析法，是利用具有一定孔徑大小的多孔凝膠作固定相的層析技術(shù)。當(dāng)混合物隨流動(dòng)相經(jīng)過(guò)凝膠層析柱時(shí)，其中各組分按其分子大小不同而被分離的技術(shù)。該法設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便、重復(fù)性好、樣品回收率高。

凝膠是一種不帶電的具有三維空間的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、呈珠狀顆粒的物質(zhì)，每個(gè)顆粒的細(xì)微結(jié)構(gòu)及篩孔的直徑均勻一致，像篩子，小的分子可以進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔，而大的分子則排阻于顆粒之外。當(dāng)含有分子大小不一的蛋白質(zhì)混合物樣品加到用此類(lèi)凝膠顆粒裝填而成的層析柱上時(shí)，這些物質(zhì)即隨洗脫液的流動(dòng)而發(fā)生移動(dòng)。大分子物質(zhì)沿凝膠顆粒間隙隨洗脫液移動(dòng)，流程短，移動(dòng)速率快，先被洗出層析柱；而小分子物質(zhì)可通過(guò)凝膠網(wǎng)孔進(jìn)入顆粒內(nèi)部，然后再擴(kuò)散出來(lái)，故流程長(zhǎng)，移動(dòng)速度慢，最后被洗出層析柱，從而使樣品中不同大小的分子彼此獲得分離。若分子大小介于上述完全排阻或完全滲入凝膠的物質(zhì)，則居二者之間從柱中流出�？傊�，各種不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)分子，最終由于它們被排阻和擴(kuò)散的程度不同，在凝膠柱中所經(jīng)過(guò)的路程和時(shí)間也不同，從而彼此可以分離開(kāi)來(lái)。

如果假定蛋白質(zhì)分子近于球形，同時(shí)沒(méi)有顯著的水合作用，則不同大小分子量的蛋白質(zhì)，在洗脫時(shí)峰的位置和該物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量有直接的定量的關(guān)系。在一根凝膠柱中，凝膠顆粒間空隙所含水相體積為外水體積VＯ，不能進(jìn)入凝膠孔徑的那些大分子，當(dāng)洗脫體積為時(shí)VＯ，出現(xiàn)洗脫峰。
凝膠顆粒內(nèi)部孔穴的總體積為內(nèi)水體積Vi，能全部滲入凝膠的那些小分子，當(dāng)洗脫體積為VＯ+Vi時(shí)，出現(xiàn)洗脫峰。
             利用Andrews的實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)式：
                                  lgMr = a/b—Ve/bVo
式中，Ve為洗脫體積。它是自加樣品開(kāi)始到該組分的洗脫峰（峰頂）出現(xiàn)時(shí)所流出的體積。Vo為外水體積，Mr為相對(duì)分子質(zhì)量，a和b為常數(shù)。
葡聚糖凝膠有不同的型號(hào)，用于分離不同相對(duì)分子質(zhì)量大小的物質(zhì)。例如Sephardex G-75的分級(jí)范圍是3000-80000的球形分子。在本實(shí)驗(yàn)中用于分離胰島素（Mr為6000）和牛血清蛋白（Mr75000）。

儀器和試劑
儀器：層析柱、恒流泵、紫外檢測(cè)儀、自動(dòng)部分收集器
試劑
待測(cè)樣品：胰島素、牛血清白蛋白
藍(lán)色葡聚糖2000；Sephardex G-75；洗脫劑
實(shí)驗(yàn)步驟
1．凝膠溶脹
          凝膠顆粒要求大小比較均勻 ，可流速穩(wěn)定，結(jié)果較好。
          取葡聚糖Sephardex G-75干粉，加過(guò)量的蒸餾水室溫充分溶脹一天（溶脹時(shí)間因凝膠交聯(lián)度不同而不同），或沸水浴中溶脹3小時(shí)，這樣可大大縮短溶脹時(shí)間，而且可以殺死細(xì)菌和霉菌，并可排出凝膠內(nèi)氣泡。溶脹過(guò)程中注意不要過(guò)分?jǐn)嚢�，以防顆粒破碎。待溶脹平衡后用傾瀉法除去不易沉下的細(xì)小顆粒，最后凝膠經(jīng)減壓抽氣除去氣泡，即可準(zhǔn)備裝柱。

2.  裝柱與平衡
       裝柱前須將凝膠上面過(guò)多的溶液傾出，將層析柱垂直裝好。關(guān)閉出口，向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，然后在攪拌下，將濃漿狀的凝膠連續(xù)地傾入柱中，使之自然沉降，待凝膠沉降約2—3cm后，打開(kāi)柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時(shí)停止裝柱，關(guān)閉出水口。裝柱要求連續(xù)、均勻、無(wú)氣泡、無(wú)“紋路”。
       將洗脫劑與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱相連。通過(guò)2—3倍柱床容積的洗脫液使柱床平衡，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，以防將來(lái)在加樣時(shí)凝膠被沖起，并始終保持凝膠上端有一段液體。

3.  上樣與洗脫
       樣品上柱是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵之一，若樣品稀釋或上柱不均，會(huì)使區(qū)帶擴(kuò)散，影響層析效果。上樣時(shí)應(yīng)盡量保持床面的穩(wěn)定。先打開(kāi)柱的出口，待柱中洗脫液流至距床表面1～2mm時(shí)，關(guān)閉出口，用滴管將1ml樣品慢慢地加至柱床表面，應(yīng)避免將床面凝膠沖起，打開(kāi)出口并開(kāi)始計(jì)算流出體積，當(dāng)樣品滲入床中接近床表面1mm時(shí)關(guān)閉出口。按加樣操作，用少量（約1ml）洗脫液沖洗管壁2次。最后加入少量洗脫液于凝膠上，使高出床表面3～5cm，旋緊上口螺絲帽，柱進(jìn)水口連通恒流泵，調(diào)好流速，以每管3ml/10min流速開(kāi)始洗脫。上樣的體積，分析用量為柱床容積的1—2%；制備用量為柱床容積的20%~30%。

4. 收集與鑒定
      用自動(dòng)部分收集器收集流出液，每管4ml，紫外檢測(cè)儀280nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，最高的一個(gè)OD值時(shí)的體積即為吸收峰的洗脫體積Ve。
5．凝膠柱的處理
      凝膠用過(guò)后，反復(fù)用蒸餾水洗后保存，如果有顏色或比較臟，可用0.5mol/LNaCl洗滌。短期可保存在水相中，加入防腐劑或加熱滅菌后于低溫保存。建議長(zhǎng)期用干燥狀態(tài)保存。
計(jì)算
   分子量的測(cè)定和計(jì)算，一般都采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法。只要測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的Ve，并以它們的相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(logMr)對(duì)Ve作圖得一直線(xiàn)，再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve，即可從圖中確定它的相對(duì)分子質(zhì)量。
注意事項(xiàng)
各接頭不能漏氣，連續(xù)用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶?jī)?nèi)的排氣管應(yīng)無(wú)液體，并隨著柱下口溶液的流出不斷有氣泡產(chǎn)生，則表示恒壓瓶不漏氣。操作過(guò)程中，層析柱內(nèi)液面不斷下降，則表示整個(gè)系統(tǒng)有漏氣之處，應(yīng)仔細(xì)檢查并加以糾正。
始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動(dòng)，導(dǎo)致分離效果變壞，不得不重新裝柱。