DNA酶切問題集錦

瀏覽次數(shù)：4885　發(fā)布日期：2008-11-28　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

我們在進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，常需要對DNA片段進(jìn)行酶切。在此，我們對酶切實(shí)驗(yàn)中遇到的一些問題做了相應(yīng)歸納。

帶型	原因	結(jié)果分析
DNA完全沒有被內(nèi)切酶切割	內(nèi)切酶失活	標(biāo)準(zhǔn)底物檢測酶活性
	DNA不純，含有SDS，酚，EDTA等內(nèi)切酶抑制因子	將DNA過柱純化，乙醇沉淀DNA
	條件不適（試劑、溫度）	檢查反應(yīng)系統(tǒng)是否最佳
	DNA酶切位點(diǎn)上的堿基被甲基化	換用對DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至dcm-，dam-基因型的細(xì)菌菌株
	DNA酶切位點(diǎn)上沒有甲基化（如Dpn I）	換用不同切割非甲基化位點(diǎn)的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至dcm+ dam+菌株中擴(kuò)增
	DNA位點(diǎn)上存在其它修飾	將DNA底物與λDAN混勻進(jìn)行切割驗(yàn)證
	DNA不存在該酶識別順序	換用其它的酶切割DNA或過量酶消化進(jìn)行驗(yàn)證
DNA切割不完全	內(nèi)切酶活性下降	用5-10倍量過量消化
	內(nèi)切酶稀釋不正確	用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶
	DNA不純，反應(yīng)條件不佳	用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶
	內(nèi)切酶識別的DNA位點(diǎn)上的堿基被甲基化或存在其它修飾	用酶貯藏液或反應(yīng)緩沖液稀釋酶
	部分DNA溶液粘在管壁上	反應(yīng)前離心數(shù)秒
	內(nèi)切酶溶液粘度大，取樣不準(zhǔn)	將內(nèi)切酶稀釋，增大取樣體積
	酶切后DNA粘末端退火	電泳前將樣品置65℃保溫5-10分鐘，取出后置冰浴驟冷
	由于反應(yīng)溶液、溫度、強(qiáng)烈振蕩使內(nèi)切酶變性	使用標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液及溫度，避免強(qiáng)烈振蕩
	過度稀釋使酶活性降低	適當(dāng)稀釋酶液，反應(yīng)液稀釋的酶不能貯藏
	反應(yīng)條件不適	使用最佳反應(yīng)體系
	識別位點(diǎn)兩側(cè)插入了可影響酶切效率的核酸順序	加大酶量5-10倍
DNA片段數(shù)目多于理倫值	內(nèi)切酶星狀活	檢查反應(yīng)條件：甘油濃度大于12%，鹽度過低，Mn2+的存在及酶：DNA值過大均均可導(dǎo)致星狀活性，降低酶的用量
	其它內(nèi)切酶污染	用λDNA作底物檢查酶切結(jié)果
	底物中含其它DNA雜質(zhì)	電泳檢查DNA，換用其它酶切，純化DNA片段
酶切后沒有觀察到DNA片段存在	DNA定量錯(cuò)誤（如RNA含量較高）	用RNA酶A（無DNA酶）100ug/ml消化DNA樣，酚抽提后沉淀溶解，定量
酶切后沒有觀察到DNA片段存在	在酶切反應(yīng)液中形成非特異的沉淀	在反應(yīng)前透析DNA樣品或用酒精沉淀二次
內(nèi)切酶保存期內(nèi)快速失活	保存溫度不合適	內(nèi)切酶貯藏在含50%甘油的貯藏液中，應(yīng)在-20℃低溫保存
	以稀釋形式保存	稀釋酶液不宜長期存放，應(yīng)一次使用
	貯藏緩沖液不適當(dāng)	使用廠家推薦的貯藏緩沖液
	低蛋白濃度	內(nèi)切酶與500ug/ml的BSA一起保存
電泳DNA片段帶型彌散不均	DNA上結(jié)合有蛋白質(zhì)	電泳前上樣液65℃加熱5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提純化
電泳DNA片段帶型彌散不均	內(nèi)切酶中含有DNA外切酶	減少酶用量或消化時(shí)間，換用新包裝的酶
酶切后的DNA片段連接效率低	含磷酸鹽的濃度高	透析，乙醇沉淀去除磷酸鹽
	內(nèi)切酶失活不全或含有ATP酶	延長滅活時(shí)間或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA
	平末端連接	加大T4 DNA Ligase用量
	外切酶污染	減少酶用量，縮短保溫時(shí)間，酚抽提回收DNA
	連接緩沖液不合適	重新配制連接緩沖液

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