激光掃描共聚焦顯微鏡在細(xì)胞凋亡研究中的應(yīng)用
摘要
激光掃描共聚焦顯微鏡作為80年代發(fā)展起來的一種高精度分子細(xì)胞生物學(xué)分析儀器，具有組織細(xì)胞斷層掃描、活細(xì)胞動(dòng)態(tài)熒光監(jiān)測、三維圖像重建、共聚焦圖像定量分析等先進(jìn)功能，在近年的細(xì)胞凋亡這一研究熱點(diǎn)中得到了大量創(chuàng)造性的應(yīng)用。本文擬就對(duì)激光掃描共聚焦顯微鏡在凋亡的形態(tài)學(xué)、分子水平變化及重要生理過程三方面研究中的應(yīng)用及其成果做一綜述。
關(guān)鍵詞 激光掃描共聚焦顯微鏡 凋亡
細(xì)胞凋亡(apoptosis)是不同于細(xì)胞壞死的一種細(xì)胞主動(dòng)死亡方式，并由特定的基因控制。凋亡細(xì)胞在形態(tài)上出現(xiàn)變圓皺縮、染色質(zhì)濃縮邊集、核碎裂、凋亡小體形成等變化，并最終由非炎癥過程清除。由于細(xì)胞凋亡獨(dú)特地影響著機(jī)體的細(xì)胞發(fā)育和代謝，在監(jiān)測和清除腫瘤細(xì)胞與突變細(xì)胞等方面也可能發(fā)揮重要的作用，近年來受到了細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等多學(xué)科的廣泛關(guān)注。
激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy,
LSCM)是80年代發(fā)展起來的一種高精度分子細(xì)胞生物學(xué)分析儀器，輔以各類免疫熒光探針或熒光染料與被測物質(zhì)特異性結(jié)合，不僅可觀察固定的細(xì)胞組織切片，還可對(duì)活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子和離子進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地觀察和檢測[1]。在細(xì)胞凋亡的研究中，激光掃描共聚焦顯微鏡已被廣泛地應(yīng)用于形態(tài)學(xué)、分子水平監(jiān)測及重要生理改變等各方面，其中不乏新穎之處，并獲得了大量成果，以下將就此做一簡單的介紹。
（生物秀儀器頻道 ）
激光掃描共聚焦顯微鏡與凋亡的形態(tài)學(xué)
激光掃描共聚焦顯微鏡用點(diǎn)光源掃描標(biāo)本的光學(xué)橫斷面，以代替普通光學(xué)顯微鏡所使用的場光源，并用探測針孔濾去離焦光線，所以消除了來自焦平面以外的衍射或散射光的干擾，可實(shí)現(xiàn)高清晰、高分辨率的組織細(xì)胞斷層掃描[2]。并且由于激光掃描共聚焦顯微鏡采用數(shù)字化成像，因而輔以一定的軟件就能對(duì)圖像進(jìn)行定量分析及三維重建等操作。過去對(duì)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)研究方法局限于活性細(xì)胞和組織切片染色、熒光鏡觀察，或者石蠟切片原位末端標(biāo)記法。由于普通光鏡的分辨率和清晰度有限，而電鏡又顯然不適合對(duì)凋亡這一復(fù)雜動(dòng)態(tài)過程的監(jiān)測，激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用使人們對(duì)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察分析提高到了一個(gè)前所未有的新水平。
細(xì)胞核
核膜的破壞對(duì)于染色質(zhì)聚集并形成凋亡小體起重要作用。lamin是構(gòu)成核片層的蛋白質(zhì)，位于核膜的內(nèi)表面，由caspase-6介導(dǎo)的lamin裂解可影響核膜的完整性[3]。在McCall等[4]的研究中，對(duì)果蠅卵子發(fā)生晚期的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察。以單抗mAb101標(biāo)記其哺育細(xì)胞核內(nèi)膜的lamin
Dm0（哺乳類lamin B的同源體），用激光掃描共聚焦顯微鏡加以觀察。正常哺育細(xì)胞到11期（stage
11）時(shí)，染色的lamin呈彌散的霧狀分布并圍繞核周，而dcp-1
GLC哺育細(xì)胞即使到了較晚的14期時(shí)，仍然顯示界線明確的染色�？梢奷cp-1突變體在核lamin蛋白的酶切或解聚方面存在缺陷。
細(xì)胞器
Li 等[5]在對(duì)C(6)-�；拾贝颊T導(dǎo)胞內(nèi)囊泡產(chǎn)生的研究中，在不產(chǎn)生中毒效應(yīng)的情況下，加入10microM C(6)-�；拾贝家哉T導(dǎo)鼠纖維母細(xì)胞
(3T3-L1和3T3-F442A)
凋亡。觀察到囊泡的形成與C(6)-�；拾贝嫉恼T導(dǎo)呈時(shí)間依從和劑量依從關(guān)系。大量小泡在其加入后8小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)，并且隨時(shí)間而增大；大泡最終分布在核周，而小泡分布在細(xì)胞邊緣。用抗-溶酶體膜蛋白抗體和共聚焦免疫熒光顯微分析，證明增大的囊泡為晚期內(nèi)吞體/溶酶體。另外，胞內(nèi)的細(xì)胞器都有其適用的熒光探針，如高爾基復(fù)合體常用的探針有NBD
ceramide、BODIPY ceramide等，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常用的有Dil、DiOC6等[6]，經(jīng)標(biāo)記均可進(jìn)行精細(xì)的觀察。
當(dāng)然，激光掃描共聚焦顯微鏡在形態(tài)學(xué)中的優(yōu)勢更在于其對(duì)圖像的三維重建功能，從而揭示過去只能在平面上顯現(xiàn)的凋亡細(xì)胞在三維空間中的結(jié)構(gòu)；而對(duì)細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)過程，它可以用三維加時(shí)間的四維方式進(jìn)行觀察，來獲取最逼真的形態(tài)學(xué)資料。凋亡過程中一些特征性的三維形態(tài)變化正期待著進(jìn)一步具體的工作去發(fā)現(xiàn)。
激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)凋亡細(xì)胞的分子水平監(jiān)測
隨著分子生物學(xué)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，關(guān)于細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的研究已有了很大的突破。細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳遞途徑及其調(diào)控涉及到大量的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)、生物大分子的空間轉(zhuǎn)移等。而激光掃描共聚焦顯微鏡以其定性、定量、定時(shí)的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合眾多熒光探針的應(yīng)用，成為了研究細(xì)胞凋亡分子水平變化的有力手段。
DNA
大分子DNA斷裂以及染色質(zhì)的異常凝聚，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[7]，同時(shí)也是細(xì)胞核在細(xì)胞凋亡中具有標(biāo)志性的變化。Columbara等[8]報(bào)道將激光掃描共聚焦顯微鏡與原位TdT和Pol
I免疫熒光技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)而確定雙鏈和單鏈DNA的斷裂點(diǎn)。而在對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死區(qū)別的研究中[9]，Kressel等在培養(yǎng)的K562細(xì)胞中加入放線菌素D以誘導(dǎo)凋亡，并對(duì)細(xì)胞的DNA片段進(jìn)行了3’-末端標(biāo)記。經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞凋亡早期有大量DNA片段出現(xiàn)，且DNA片段彌散分布于除核仁外的細(xì)胞核區(qū)。伴隨著凋亡的進(jìn)展，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)大量高標(biāo)記密度的圓形小體。而采用NaN3或快速凍融法使細(xì)胞壞死，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察證實(shí)，在壞死開始階段并無DNA片段的出現(xiàn)，至少在壞死發(fā)生24小時(shí)后才有DNA片段產(chǎn)生。
Caspase家族
Caspases是一組高度保守的半胱氨酸蛋白酶，目前發(fā)現(xiàn)有11個(gè)成員。多數(shù)細(xì)胞凋亡是以Caspase家族蛋白的激活并作用于其關(guān)鍵底物而實(shí)現(xiàn)的，而caspases激活的關(guān)鍵又在于該家族蛋白間的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]，因此caspases被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者，成為研究的熱點(diǎn)。
Mandal等[11]用激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞凋亡中激活的caspase-3的重分布進(jìn)行了研究。用丁酸處理細(xì)胞后，觀察到DNA-PKcs的裂解與caspase-3的激活成正相關(guān)，而Bcl-2的過度表達(dá)則可抑制上述兩個(gè)過程。同時(shí)還證明（1）激活后的caspase-3重分布到核區(qū)，（2）裂解局部的DNA-PKcs和PARP（polyADP-ribose
polymerase，聚腺苷二磷酸核糖多聚酶），（3）裂解產(chǎn)物又被釋放到核外的細(xì)胞液。caspase-3的抑制物四肽DEVD-CHO又可抑制上述的三個(gè)連續(xù)的步驟。該研究提示：激活的caspase-3在核內(nèi)的重分布構(gòu)成了丁酸所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的一個(gè)重要凋亡信號(hào)。
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另外，在用激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)Q79誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元凋亡的研究[12]中，Sanchez等發(fā)現(xiàn)了Q79對(duì)caspase-8的聚集和激活，而對(duì)caspase-8的抑制則阻止了被誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；加以Western
blot分析，還建立了caspase-8的激活和某些神經(jīng)退行性疾�。ㄈ缥璧覆。┑穆�(lián)系。
Grazyme
絲氨酸蛋白酶grazyme為另一種重要的凋亡信號(hào)分子，對(duì)某些caspase家族蛋白也有激活作用。Trapani等[13]就證明了殺傷淋巴細(xì)胞利用穿孔素和grazyme
B的協(xié)同作用來誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡，在其研究中通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到（1）50%細(xì)胞的胞核內(nèi)快速聚集了以FITC熒光標(biāo)記的grazyme
B（最長7分鐘，t1/2為2分鐘），然后發(fā)生凋亡；（2）其它的細(xì)胞只有細(xì)胞液內(nèi)有FITC-grazyme
B的攝取，避免了凋亡。此間至少在13分鐘后才有DNA碎片的出現(xiàn)，說明核內(nèi)的grazyme B聚集出現(xiàn)在凋亡的執(zhí)行階段之前。并且通過對(duì)核內(nèi)液的處理（加入70KDa
FITC-dextran），間接觀察到grazyme B的轉(zhuǎn)移并非是因?yàn)楹四な躢aspases的作用而破損，而是由于穿孔素的協(xié)同。
其它
以上的介紹顯示，激光掃描共聚焦顯微鏡在檢測活細(xì)胞酶活性動(dòng)態(tài)變化方面有著突出的優(yōu)勢。實(shí)際上，對(duì)于細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制這樣一個(gè)極其復(fù)雜的課題，激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用遠(yuǎn)不只限于上述的幾種離子和大分子，而是滲透到了大量的分枝課題中去。如在對(duì)重要的凋亡負(fù)調(diào)控蛋白Bcl-2的研究中，Beham等[14]利用基因毒性損害（genotoxic
damage）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并以Bcl-2蛋白抑制其凋亡過程。用激光掃描共聚焦顯微鏡和Immunoblotting觀察顯示，Bcl-2的作用在于阻止了誘導(dǎo)產(chǎn)生的p53蛋白向核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。而Ohsawa等[15]對(duì)獨(dú)立于caspase家族的另一種重要蛋白酶—組織蛋白酶進(jìn)行了研究，用血清剝奪法誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，并用激光掃描共聚焦顯微鏡監(jiān)測了其精細(xì)超微結(jié)構(gòu)改變過程和細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶B和D的免疫活度的對(duì)比變化。又如，在人胰島淀粉樣多肽（hIAPP）的研究中，Hiddinga等[16]用表達(dá)hIAPP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡，輔以免疫組化染色，用激光掃描共聚焦顯微鏡證明了hIAPP在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體內(nèi)呈簇狀沉積，并與細(xì)胞凋亡成相關(guān)關(guān)系�？傊S著在凋亡中扮演重要角色的生物大分子的不斷發(fā)現(xiàn)，激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用還會(huì)更為寬廣，成為監(jiān)測生物大分子在時(shí)間、空間上動(dòng)態(tài)分布的重要工具。
激光掃描共聚焦顯微鏡與凋亡中的重要生理過程研究
游離鈣分析
Ca2+在多條信號(hào)傳遞通路中發(fā)揮著重要的作用，在細(xì)胞凋亡中也不例外。用激光掃描共聚焦顯微鏡輔以鈣熒光探針活體測量[Ca2+]較之傳統(tǒng)方法具有無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，如熒光探針易于導(dǎo)入，空間分辨率高，反應(yīng)速度快，多離子同時(shí)測定等[17]。
在對(duì)大鼠胸腺細(xì)胞凋亡的研究中[18]，采用毒胡蘿卜素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)胞內(nèi)游離Ca2+信號(hào)對(duì)胸腺細(xì)胞凋亡激活作用的研究發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡所需毒胡蘿卜素的最低濃度為1µM，而此誘發(fā)過程可被Ca2+螯合劑所阻斷，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)凋亡核的形成和廣泛的DNA斷裂現(xiàn)象，結(jié)果表明毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的Ca2+增加信號(hào)足以激活胸腺細(xì)胞的凋亡。另外，F(xiàn)ang等[19]對(duì)高效抗癌化療藥物Harringtonine(HT）快速誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象進(jìn)行研究，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察證實(shí)了該凋亡過程中的兩個(gè)連續(xù)過程，即Ca2+離子在細(xì)胞核內(nèi)的積聚及其進(jìn)一步的核內(nèi)區(qū)域化。
線粒體膜電位測定
激光掃描共聚焦顯微鏡可輔以電位敏感性熒光染料進(jìn)行間接的膜電位測量。通過測量生物膜兩側(cè)的熒光強(qiáng)度，代入Nernst方程即可算得該膜兩側(cè)的電位差。因?yàn)榧す鈷呙韫簿劢癸@微鏡能有效地排除非焦平面的熒光，因而較之普通熒光顯微鏡能獲得更為準(zhǔn)確的膜內(nèi)外熒光值，避免了可能產(chǎn)生的嚴(yán)重誤差。正是激光掃描共聚焦顯微鏡的這一功能，被應(yīng)用于細(xì)胞凋亡中一熱點(diǎn)問題的探討，即線粒體膜電位改變（MPT）、細(xì)胞色素C的釋放與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
在Heiskanen等人的研究中[20]，應(yīng)用了四甲基羅丹明甲酯（TMRM）來監(jiān)測線粒體的膜電位。在其實(shí)驗(yàn)中，用staurosporine誘導(dǎo)單個(gè)PC-6活細(xì)胞的凋亡，同時(shí)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察了細(xì)胞色素C的釋放與MPT之間的時(shí)間關(guān)系。結(jié)果在用staurosporine后的2小時(shí)到7小時(shí)，線粒體膜電位發(fā)生了急劇的下降；并用綠熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞色素C，發(fā)現(xiàn)線粒體膜去極化伴隨細(xì)胞色素C的釋放。進(jìn)而，細(xì)胞色素C參加到caspase家族蛋白的激活過程中，使細(xì)胞最終走向死亡。另外，Minamikawa等[21]也對(duì)線粒體在細(xì)胞凋亡中扮演的角色進(jìn)行了研究，在該實(shí)驗(yàn)中，Mitotracker
Red被用以標(biāo)記線粒體，它具有極強(qiáng)的光敏化作用和潛在的光毒性。當(dāng)向胞內(nèi)加入100nM
該熒光探針后，用激光掃描共聚焦顯微鏡成像，常規(guī)掃描所用的激光束在此時(shí)通過Mitotracker
Red產(chǎn)生光毒性誘導(dǎo)線粒體的損傷，同時(shí)可見線粒體去極化指示劑羅丹明-123的熒光強(qiáng)度迅速下降，說明線粒體發(fā)生了快速去極化，而殘余的少量Mitotracker
Red則使線粒體在損傷后15分鐘內(nèi)的球狀腫脹得以顯現(xiàn)；對(duì)細(xì)胞色素C的免疫組化染色也顯示在上述光照后細(xì)胞色素C由線粒體彌散到胞漿中的現(xiàn)象。
結(jié)語
在當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)的研究中，從分析走向綜合、從靜態(tài)走向動(dòng)態(tài)、從現(xiàn)象走向本質(zhì)是一個(gè)大趨勢。在細(xì)胞凋亡這個(gè)誘人課題的研究中，有復(fù)雜的生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，有精細(xì)交織的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，有生物膜電位的改變以及最終形態(tài)上的大體變化，激光掃描共聚焦顯微鏡作為一種全新的實(shí)驗(yàn)手段，輔以眾多熒光探針的創(chuàng)造性運(yùn)用，的確顯示出了強(qiáng)大的生命力。
同時(shí)，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到只有選擇合適的熒光探針，才能保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行并獲得理想的結(jié)果。因此，選擇熒光探針時(shí)須考慮到：（1）現(xiàn)有儀器所采用的激光器，（2）熒光探針的光穩(wěn)定性和光漂白性，（3）熒光的定性或定量，（4）熒光探針的特異性和毒性，（5）熒光探針適用的PH值[22]。另外，激光掃描共聚焦顯微鏡的有效應(yīng)用尚需與其它技術(shù)聯(lián)合互補(bǔ)，如對(duì)膜電位的定量研究中，可用微電極進(jìn)行膜片鉗記錄或胞內(nèi)記錄，在測量膜電位同時(shí)測量熒光信號(hào)，以求出標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]。
總而言之，從激光掃描共聚焦顯微鏡在細(xì)胞凋亡研究中應(yīng)用可以展望，這項(xiàng)多功能、高精度、自動(dòng)化的實(shí)驗(yàn)手段必會(huì)在將來的科學(xué)研究中發(fā)揮更加重要的作用。
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作者：劉暢等 來源：華西醫(yī)科大學(xué)附一院
劉暢 顧玲 綜述 步宏 審校
（華西醫(yī)科大學(xué)附一院 移植免疫實(shí)驗(yàn)室，610044）
激光掃描共聚焦顯微鏡作為80年代發(fā)展起來的一種高精度分子細(xì)胞生物學(xué)分析儀器，具有組織細(xì)胞斷層掃描、活細(xì)胞動(dòng)態(tài)熒光監(jiān)測、三維圖像重建、共聚焦圖像定量分析等先進(jìn)功能，在近年的細(xì)胞凋亡這一研究熱點(diǎn)中得到了大量創(chuàng)造性的應(yīng)用。本文擬就對(duì)激光掃描共聚焦顯微鏡在凋亡的形態(tài)學(xué)、分子水平變化及重要生理過程三方面研究中的應(yīng)用及其成果做一綜述。
關(guān)鍵詞 激光掃描共聚焦顯微鏡 凋亡
細(xì)胞凋亡(apoptosis)是不同于細(xì)胞壞死的一種細(xì)胞主動(dòng)死亡方式，并由特定的基因控制。凋亡細(xì)胞在形態(tài)上出現(xiàn)變圓皺縮、染色質(zhì)濃縮邊集、核碎裂、凋亡小體形成等變化，并最終由非炎癥過程清除。由于細(xì)胞凋亡獨(dú)特地影響著機(jī)體的細(xì)胞發(fā)育和代謝，在監(jiān)測和清除腫瘤細(xì)胞與突變細(xì)胞等方面也可能發(fā)揮重要的作用，近年來受到了細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等多學(xué)科的廣泛關(guān)注。
激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy,
LSCM)是80年代發(fā)展起來的一種高精度分子細(xì)胞生物學(xué)分析儀器，輔以各類免疫熒光探針或熒光染料與被測物質(zhì)特異性結(jié)合，不僅可觀察固定的細(xì)胞組織切片，還可對(duì)活細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、分子和離子進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地觀察和檢測[1]。在細(xì)胞凋亡的研究中，激光掃描共聚焦顯微鏡已被廣泛地應(yīng)用于形態(tài)學(xué)、分子水平監(jiān)測及重要生理改變等各方面，其中不乏新穎之處，并獲得了大量成果，以下將就此做一簡單的介紹。
（生物秀儀器頻道 ）
激光掃描共聚焦顯微鏡與凋亡的形態(tài)學(xué)
激光掃描共聚焦顯微鏡用點(diǎn)光源掃描標(biāo)本的光學(xué)橫斷面，以代替普通光學(xué)顯微鏡所使用的場光源，并用探測針孔濾去離焦光線，所以消除了來自焦平面以外的衍射或散射光的干擾，可實(shí)現(xiàn)高清晰、高分辨率的組織細(xì)胞斷層掃描[2]。并且由于激光掃描共聚焦顯微鏡采用數(shù)字化成像，因而輔以一定的軟件就能對(duì)圖像進(jìn)行定量分析及三維重建等操作。過去對(duì)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)研究方法局限于活性細(xì)胞和組織切片染色、熒光鏡觀察，或者石蠟切片原位末端標(biāo)記法。由于普通光鏡的分辨率和清晰度有限，而電鏡又顯然不適合對(duì)凋亡這一復(fù)雜動(dòng)態(tài)過程的監(jiān)測，激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用使人們對(duì)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察分析提高到了一個(gè)前所未有的新水平。
細(xì)胞核
核膜的破壞對(duì)于染色質(zhì)聚集并形成凋亡小體起重要作用。lamin是構(gòu)成核片層的蛋白質(zhì)，位于核膜的內(nèi)表面，由caspase-6介導(dǎo)的lamin裂解可影響核膜的完整性[3]。在McCall等[4]的研究中，對(duì)果蠅卵子發(fā)生晚期的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察。以單抗mAb101標(biāo)記其哺育細(xì)胞核內(nèi)膜的lamin
Dm0（哺乳類lamin B的同源體），用激光掃描共聚焦顯微鏡加以觀察。正常哺育細(xì)胞到11期（stage
11）時(shí)，染色的lamin呈彌散的霧狀分布并圍繞核周，而dcp-1
GLC哺育細(xì)胞即使到了較晚的14期時(shí)，仍然顯示界線明確的染色�？梢奷cp-1突變體在核lamin蛋白的酶切或解聚方面存在缺陷。
細(xì)胞器
Li 等[5]在對(duì)C(6)-�；拾贝颊T導(dǎo)胞內(nèi)囊泡產(chǎn)生的研究中，在不產(chǎn)生中毒效應(yīng)的情況下，加入10microM C(6)-�；拾贝家哉T導(dǎo)鼠纖維母細(xì)胞
(3T3-L1和3T3-F442A)
凋亡。觀察到囊泡的形成與C(6)-�；拾贝嫉恼T導(dǎo)呈時(shí)間依從和劑量依從關(guān)系。大量小泡在其加入后8小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)，并且隨時(shí)間而增大；大泡最終分布在核周，而小泡分布在細(xì)胞邊緣。用抗-溶酶體膜蛋白抗體和共聚焦免疫熒光顯微分析，證明增大的囊泡為晚期內(nèi)吞體/溶酶體。另外，胞內(nèi)的細(xì)胞器都有其適用的熒光探針，如高爾基復(fù)合體常用的探針有NBD
ceramide、BODIPY ceramide等，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)常用的有Dil、DiOC6等[6]，經(jīng)標(biāo)記均可進(jìn)行精細(xì)的觀察。
當(dāng)然，激光掃描共聚焦顯微鏡在形態(tài)學(xué)中的優(yōu)勢更在于其對(duì)圖像的三維重建功能，從而揭示過去只能在平面上顯現(xiàn)的凋亡細(xì)胞在三維空間中的結(jié)構(gòu)；而對(duì)細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)過程，它可以用三維加時(shí)間的四維方式進(jìn)行觀察，來獲取最逼真的形態(tài)學(xué)資料。凋亡過程中一些特征性的三維形態(tài)變化正期待著進(jìn)一步具體的工作去發(fā)現(xiàn)。
激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)凋亡細(xì)胞的分子水平監(jiān)測
隨著分子生物學(xué)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，關(guān)于細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的研究已有了很大的突破。細(xì)胞凋亡的信號(hào)傳遞途徑及其調(diào)控涉及到大量的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)、生物大分子的空間轉(zhuǎn)移等。而激光掃描共聚焦顯微鏡以其定性、定量、定時(shí)的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合眾多熒光探針的應(yīng)用，成為了研究細(xì)胞凋亡分子水平變化的有力手段。
DNA
大分子DNA斷裂以及染色質(zhì)的異常凝聚，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵[7]，同時(shí)也是細(xì)胞核在細(xì)胞凋亡中具有標(biāo)志性的變化。Columbara等[8]報(bào)道將激光掃描共聚焦顯微鏡與原位TdT和Pol
I免疫熒光技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)而確定雙鏈和單鏈DNA的斷裂點(diǎn)。而在對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死區(qū)別的研究中[9]，Kressel等在培養(yǎng)的K562細(xì)胞中加入放線菌素D以誘導(dǎo)凋亡，并對(duì)細(xì)胞的DNA片段進(jìn)行了3’-末端標(biāo)記。經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)K562細(xì)胞凋亡早期有大量DNA片段出現(xiàn)，且DNA片段彌散分布于除核仁外的細(xì)胞核區(qū)。伴隨著凋亡的進(jìn)展，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)大量高標(biāo)記密度的圓形小體。而采用NaN3或快速凍融法使細(xì)胞壞死，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察證實(shí)，在壞死開始階段并無DNA片段的出現(xiàn)，至少在壞死發(fā)生24小時(shí)后才有DNA片段產(chǎn)生。
Caspase家族
Caspases是一組高度保守的半胱氨酸蛋白酶，目前發(fā)現(xiàn)有11個(gè)成員。多數(shù)細(xì)胞凋亡是以Caspase家族蛋白的激活并作用于其關(guān)鍵底物而實(shí)現(xiàn)的，而caspases激活的關(guān)鍵又在于該家族蛋白間的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[10]，因此caspases被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)和執(zhí)行者，成為研究的熱點(diǎn)。
Mandal等[11]用激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞凋亡中激活的caspase-3的重分布進(jìn)行了研究。用丁酸處理細(xì)胞后，觀察到DNA-PKcs的裂解與caspase-3的激活成正相關(guān)，而Bcl-2的過度表達(dá)則可抑制上述兩個(gè)過程。同時(shí)還證明（1）激活后的caspase-3重分布到核區(qū)，（2）裂解局部的DNA-PKcs和PARP（polyADP-ribose
polymerase，聚腺苷二磷酸核糖多聚酶），（3）裂解產(chǎn)物又被釋放到核外的細(xì)胞液。caspase-3的抑制物四肽DEVD-CHO又可抑制上述的三個(gè)連續(xù)的步驟。該研究提示：激活的caspase-3在核內(nèi)的重分布構(gòu)成了丁酸所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的一個(gè)重要凋亡信號(hào)。
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另外，在用激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)Q79誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元凋亡的研究[12]中，Sanchez等發(fā)現(xiàn)了Q79對(duì)caspase-8的聚集和激活，而對(duì)caspase-8的抑制則阻止了被誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；加以Western
blot分析，還建立了caspase-8的激活和某些神經(jīng)退行性疾�。ㄈ缥璧覆。┑穆�(lián)系。
Grazyme
絲氨酸蛋白酶grazyme為另一種重要的凋亡信號(hào)分子，對(duì)某些caspase家族蛋白也有激活作用。Trapani等[13]就證明了殺傷淋巴細(xì)胞利用穿孔素和grazyme
B的協(xié)同作用來誘導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡，在其研究中通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到（1）50%細(xì)胞的胞核內(nèi)快速聚集了以FITC熒光標(biāo)記的grazyme
B（最長7分鐘，t1/2為2分鐘），然后發(fā)生凋亡；（2）其它的細(xì)胞只有細(xì)胞液內(nèi)有FITC-grazyme
B的攝取，避免了凋亡。此間至少在13分鐘后才有DNA碎片的出現(xiàn)，說明核內(nèi)的grazyme B聚集出現(xiàn)在凋亡的執(zhí)行階段之前。并且通過對(duì)核內(nèi)液的處理（加入70KDa
FITC-dextran），間接觀察到grazyme B的轉(zhuǎn)移并非是因?yàn)楹四な躢aspases的作用而破損，而是由于穿孔素的協(xié)同。
其它
以上的介紹顯示，激光掃描共聚焦顯微鏡在檢測活細(xì)胞酶活性動(dòng)態(tài)變化方面有著突出的優(yōu)勢。實(shí)際上，對(duì)于細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制這樣一個(gè)極其復(fù)雜的課題，激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用遠(yuǎn)不只限于上述的幾種離子和大分子，而是滲透到了大量的分枝課題中去。如在對(duì)重要的凋亡負(fù)調(diào)控蛋白Bcl-2的研究中，Beham等[14]利用基因毒性損害（genotoxic
damage）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并以Bcl-2蛋白抑制其凋亡過程。用激光掃描共聚焦顯微鏡和Immunoblotting觀察顯示，Bcl-2的作用在于阻止了誘導(dǎo)產(chǎn)生的p53蛋白向核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。而Ohsawa等[15]對(duì)獨(dú)立于caspase家族的另一種重要蛋白酶—組織蛋白酶進(jìn)行了研究，用血清剝奪法誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，并用激光掃描共聚焦顯微鏡監(jiān)測了其精細(xì)超微結(jié)構(gòu)改變過程和細(xì)胞內(nèi)組織蛋白酶B和D的免疫活度的對(duì)比變化。又如，在人胰島淀粉樣多肽（hIAPP）的研究中，Hiddinga等[16]用表達(dá)hIAPP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡，輔以免疫組化染色，用激光掃描共聚焦顯微鏡證明了hIAPP在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體內(nèi)呈簇狀沉積，并與細(xì)胞凋亡成相關(guān)關(guān)系�？傊S著在凋亡中扮演重要角色的生物大分子的不斷發(fā)現(xiàn)，激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用還會(huì)更為寬廣，成為監(jiān)測生物大分子在時(shí)間、空間上動(dòng)態(tài)分布的重要工具。
激光掃描共聚焦顯微鏡與凋亡中的重要生理過程研究
游離鈣分析
Ca2+在多條信號(hào)傳遞通路中發(fā)揮著重要的作用，在細(xì)胞凋亡中也不例外。用激光掃描共聚焦顯微鏡輔以鈣熒光探針活體測量[Ca2+]較之傳統(tǒng)方法具有無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，如熒光探針易于導(dǎo)入，空間分辨率高，反應(yīng)速度快，多離子同時(shí)測定等[17]。
在對(duì)大鼠胸腺細(xì)胞凋亡的研究中[18]，采用毒胡蘿卜素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，經(jīng)激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)胞內(nèi)游離Ca2+信號(hào)對(duì)胸腺細(xì)胞凋亡激活作用的研究發(fā)現(xiàn)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡所需毒胡蘿卜素的最低濃度為1µM，而此誘發(fā)過程可被Ca2+螯合劑所阻斷，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)凋亡核的形成和廣泛的DNA斷裂現(xiàn)象，結(jié)果表明毒胡蘿卜素誘導(dǎo)的Ca2+增加信號(hào)足以激活胸腺細(xì)胞的凋亡。另外，F(xiàn)ang等[19]對(duì)高效抗癌化療藥物Harringtonine(HT）快速誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象進(jìn)行研究，用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察證實(shí)了該凋亡過程中的兩個(gè)連續(xù)過程，即Ca2+離子在細(xì)胞核內(nèi)的積聚及其進(jìn)一步的核內(nèi)區(qū)域化。
線粒體膜電位測定
激光掃描共聚焦顯微鏡可輔以電位敏感性熒光染料進(jìn)行間接的膜電位測量。通過測量生物膜兩側(cè)的熒光強(qiáng)度，代入Nernst方程即可算得該膜兩側(cè)的電位差。因?yàn)榧す鈷呙韫簿劢癸@微鏡能有效地排除非焦平面的熒光，因而較之普通熒光顯微鏡能獲得更為準(zhǔn)確的膜內(nèi)外熒光值，避免了可能產(chǎn)生的嚴(yán)重誤差。正是激光掃描共聚焦顯微鏡的這一功能，被應(yīng)用于細(xì)胞凋亡中一熱點(diǎn)問題的探討，即線粒體膜電位改變（MPT）、細(xì)胞色素C的釋放與細(xì)胞凋亡的關(guān)系。
在Heiskanen等人的研究中[20]，應(yīng)用了四甲基羅丹明甲酯（TMRM）來監(jiān)測線粒體的膜電位。在其實(shí)驗(yàn)中，用staurosporine誘導(dǎo)單個(gè)PC-6活細(xì)胞的凋亡，同時(shí)用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察了細(xì)胞色素C的釋放與MPT之間的時(shí)間關(guān)系。結(jié)果在用staurosporine后的2小時(shí)到7小時(shí)，線粒體膜電位發(fā)生了急劇的下降；并用綠熒光蛋白標(biāo)記細(xì)胞色素C，發(fā)現(xiàn)線粒體膜去極化伴隨細(xì)胞色素C的釋放。進(jìn)而，細(xì)胞色素C參加到caspase家族蛋白的激活過程中，使細(xì)胞最終走向死亡。另外，Minamikawa等[21]也對(duì)線粒體在細(xì)胞凋亡中扮演的角色進(jìn)行了研究，在該實(shí)驗(yàn)中，Mitotracker
Red被用以標(biāo)記線粒體，它具有極強(qiáng)的光敏化作用和潛在的光毒性。當(dāng)向胞內(nèi)加入100nM
該熒光探針后，用激光掃描共聚焦顯微鏡成像，常規(guī)掃描所用的激光束在此時(shí)通過Mitotracker
Red產(chǎn)生光毒性誘導(dǎo)線粒體的損傷，同時(shí)可見線粒體去極化指示劑羅丹明-123的熒光強(qiáng)度迅速下降，說明線粒體發(fā)生了快速去極化，而殘余的少量Mitotracker
Red則使線粒體在損傷后15分鐘內(nèi)的球狀腫脹得以顯現(xiàn)；對(duì)細(xì)胞色素C的免疫組化染色也顯示在上述光照后細(xì)胞色素C由線粒體彌散到胞漿中的現(xiàn)象。
結(jié)語
在當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)的研究中，從分析走向綜合、從靜態(tài)走向動(dòng)態(tài)、從現(xiàn)象走向本質(zhì)是一個(gè)大趨勢。在細(xì)胞凋亡這個(gè)誘人課題的研究中，有復(fù)雜的生化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，有精細(xì)交織的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，有生物膜電位的改變以及最終形態(tài)上的大體變化，激光掃描共聚焦顯微鏡作為一種全新的實(shí)驗(yàn)手段，輔以眾多熒光探針的創(chuàng)造性運(yùn)用，的確顯示出了強(qiáng)大的生命力。
同時(shí)，應(yīng)該認(rèn)識(shí)到只有選擇合適的熒光探針，才能保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行并獲得理想的結(jié)果。因此，選擇熒光探針時(shí)須考慮到：（1）現(xiàn)有儀器所采用的激光器，（2）熒光探針的光穩(wěn)定性和光漂白性，（3）熒光的定性或定量，（4）熒光探針的特異性和毒性，（5）熒光探針適用的PH值[22]。另外，激光掃描共聚焦顯微鏡的有效應(yīng)用尚需與其它技術(shù)聯(lián)合互補(bǔ)，如對(duì)膜電位的定量研究中，可用微電極進(jìn)行膜片鉗記錄或胞內(nèi)記錄，在測量膜電位同時(shí)測量熒光信號(hào)，以求出標(biāo)準(zhǔn)曲線[17]。
總而言之，從激光掃描共聚焦顯微鏡在細(xì)胞凋亡研究中應(yīng)用可以展望，這項(xiàng)多功能、高精度、自動(dòng)化的實(shí)驗(yàn)手段必會(huì)在將來的科學(xué)研究中發(fā)揮更加重要的作用。
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作者：劉暢等 來源：華西醫(yī)科大學(xué)附一院
劉暢 顧玲 綜述 步宏 審校
（華西醫(yī)科大學(xué)附一院 移植免疫實(shí)驗(yàn)室，610044）
標(biāo)簽：
激光掃描共聚焦顯微鏡 凋亡
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