染色體顯微切割及新進展
提要 染色體顯微切割技術是細胞遺傳學與分子遺傳學相結(jié)合的一項橋梁技術。近年來，該技術在同源基因的定位和克隆的價值深受關注。本文結(jié)合顯微切割的經(jīng)驗，對其應用和新進展進行了綜述。
完成人類基因組計劃的全序列分析，需要構建基因高分辨遺傳圖譜和物理圖譜，如何快速有效的獲得染色體區(qū)帶特異性的序列標簽位點（STS）及表達序列標檢（EST），構建克隆連鎖群，分階段有序列的完成特定區(qū)帶全序列分析，染色體顯微切割技術顯示出無可比擬的優(yōu)越性。該技術自80年代初問世以來，通過與PCR、微克隆、FISH、DNA測序、文庫篩選、比較基因組雜交等分子生物學技術相結(jié)合，在染色病研究與診斷、文庫構建、基因定位與克隆、以及進化遺傳學與腫瘤遺傳學等方面的研究中取得了令人矚目的成績，并以其獨特的直接性和實用性保持其分子生物學領域良好的應用前景。
一、歷史回顧
1981年，德國的歐洲分子生物學實驗室（EMBL）Scalenghe等[1]切割了果蠅吃得開液腺多線期X染色體第3段的幾個片段，通過蛋白酶消化、酚抽提、EcoRI酶切進行重組克隆。1984年染色體顯微切割應用小氧，1986年Bates等[2]切割了人的2號染色體短臂。但當時由于所切割的染色體DNA量少，通常要切割上百條染色體，且其文庫也只含幾百個微克隆。顯微切割技術的第一閃重在突破在于它與PCR的結(jié)合，1989年Ludecke等[3]切割了人類G顯帶染色體，結(jié)合PCR技術進行體外擴增，使其工作量大大減小。鄧漢湘等[4]則創(chuàng)造性的設計了linker-priner粘端接頭，提高了連接效率，增高了文庫質(zhì)量。而1992年Melter等［5］在PCR擴增過程中引入簡并引物，在減少工作量的同時，還解決了探針片段受酶切位點限制、文庫不全和部分序列高度富集的現(xiàn)象，是染色體顯微切割領域的又一重大突破。
二、探針池或文庫質(zhì)量的控制
顯微切割是一項極其精細的工作，需要有熟練的技術和嚴格的防塵措施。通常一個好的文庫存至少覆蓋50%以上所切割的染色體區(qū)域，而且不應存在一些片段在PCR過程中的高度富集，才能保證以后研究中能分離較多的特異性DNA片段。污染的來源可以從以下幾個方面進行控制。
1.實驗試劑和用具
實驗操作臺要保持相對無菌，實驗操作人員要戴口罩。所用緩沖液應用0.22μM過濾器除菌，切割針對可用紫外線照射30分鐘或干熱滅菌。盡量使用一次性無菌用品。
2.染色體切割玻片的制備
雖然切割常規(guī)G帶片段通過FISH雜交得到陽性信號，甚至使用-20℃固定3年的細胞懸液制片也可能有滿意的結(jié)果[6]，但長時間的酸固定和暴露于空氣中可造成克隆插入子片段子[7，8]。Hagng等[9]為減少冰醋酸固定細胞引起DNA降解而采用速固定和乙醇洗脫。
3.切割方法的選擇
染色體顯微切割分手工切割和激光切割法[10～13]。前者較不常用，其方法是在倒置顯微鏡上裝配切割臂，安上硅化玻璃針，找到分散良好的分裂相來切割所需染色體片段。所切割染色體片段在油室中操作則操作繁瑣，而在Eppendorf管中操作污染較多。激光切割法分三步[4]：（1）自動澆灼：常規(guī)將所切割的染色體周圍核型及細胞核用激光澆灼；（2）手工澆灼：澆灼切割核型內(nèi)除切割區(qū)帶以外的染色體；（3）比率確定：精細切割區(qū)帶邊緣。激光能切割不太分散的分裂相，污染小，提高了成功率，但需要較高的設備條件，推廣較困難。
4.引物設計
染色體顯微切割引物分特異性引物和簡并引物。特異性引物有外源性和內(nèi)源性兩種。Ludecke等將內(nèi)切割片段克隆進puc載體，再用SamI酶切后puc上序列作特異性外源引物PCR擴增后將PCR產(chǎn)物克隆到puc13中，構建了染色體8q23-q24文庫�；蚨ㄎ粍t常用特異性內(nèi)源性引物[15，16]，即基因組DNA的一段特性性序列。簡并性引物以5%26acute;-CCGACTC-GAGNNNNNNATGTGG-3%26acute;(N=A,T,G,C各25%)[17]最為常用，它比六個簡并核苷酸置于3%26acute;末端[18]污染少，但簡并性效果差些。簡并的引物可自行擴增[19]造成探針池和文庫的質(zhì)量下降，但由于其操作簡單，免去酚仿抽提、連接等步驟，又能相對減少污染。Tokayama等采用簡并寡核引物穿梭PCR（Dop-shutter-PCR）提高了探針池的特異性。
5.PCR擴增周期
PCR大大減少了切割工作量，提高了成功率，甚至一個 dNA拷貝也能擴增成功[20]。但PCR擴增周期增加會導致文庫質(zhì)量下降，而FISH信號不一定減弱[21]。只要有某些片段在PCR中稍易擴增，就易引起這些片段的富集，Stefank等[18]在66個克隆中發(fā)現(xiàn)一個克隆出現(xiàn)8次。然而另一些資料顯示，由于簡并，PCR擴增呈序列非依賴性，甚至2kbDNA模板也可擴增出不同大小的片段，在瓊脂上無明顯條帶。
三、應用
隨著生命科學領域細胞分子水平研究的深入，染色體顯微切割在人、果蠅[1]、大鼠[22]、小鼠[23～25]、豬[26]等染色體研究中都有所應用，其應用價值和應用前景主要以有幾個方面。
1.染色體水平的研究
應用顯微切割構建的染色體特異性和染色體區(qū)帶特異性探針池，與可疑患者染色體進行正向染色體涂染[27]，或直接切割標記染色體，進行反向染色體涂染，可以用于研究標記染色體[28]，單體、三體、雙微體、易位、缺失[29]以及染色體均染區(qū)（HSR）的來源、結(jié)構和形成機制等。Tigand等[30]用顯微切割構建的區(qū)帶特異性探針池發(fā)現(xiàn)脊髓發(fā)育不良病人中有5q-;而Engelen等[31]發(fā)現(xiàn)了5個斷裂點的染色體復雜重排。染色體顯微切割在染色體病產(chǎn)前診斷[32]與產(chǎn)后分析中發(fā)揮了重要的作用[33]。
2.分子水平的研究
�。�1）構建染色體特異性和區(qū)帶異性文庫
染色體顯微切割、PCR得到的探針長度通常為150～1500bp，一般可以用來構建質(zhì)粒gDNA文庫[34]。而Hozier等[35]將cDNA原位雜交與染色體顯微切割結(jié)合起來，構建了鼠4號染色體C3-7區(qū)帶文庫。1996年 Yokoyama等[36]從胎腦mRNA反轉(zhuǎn)錄合成了第一鏈cDNA，再用兩步擴增法—Dop-shutter-PCR合成短片段cDNA，雜交于包括兩個近端著絲粒的K562細胞系中期分裂相，再切割標記染色體，發(fā)現(xiàn)81.5%克隆來源于所切割的相應區(qū)域，8個單拷貝序列中有5個是新的cDNA序列，僅1個來自于非切割區(qū)。應用顯微切割所構建的探針池也可通過文庫篩選快速分離區(qū)帶特異性文庫[37]Abdel等[38]則分離構建了包括700個Cosmid的12號染色體區(qū)帶特異性Cosmid亞文庫。
�。�2）構建整條染色體重疊群
關等[21]切割了人類6號染色體13個彼此相鄰的不同區(qū)帶探針池，由此構建了6號染色體重疊群。
�。�3）構建DNA圖譜
STS和EST為DNA制圖中一種重要的物理界標。人類基因組計劃原定目標是獲得分布于整個基因組約30000STS。使每隔100kb就有一個標記。Soejima等[39]通過顯微切割分離了11q13.4-q25的50個STS。而建立全基因組的基因圖，將加速對簡單孟德爾性狀基因的搜尋和對復雜性狀基因的認識，同時cDNA系列可以申請專利，這就激發(fā)了許多藥物公司對cDNA測序的興趣。用顯微切割構建cDNA區(qū)帶文庫，無論是DNA序列分析還是致病基因的定位侯選克隆都有深遠意義。
�。�4）染色體工勻染區(qū)（HSR）的研究
HSR是可見的基本擴增區(qū)，Xu等[40]發(fā)現(xiàn)在小細胞肺癌中11q13有基因擴增后再發(fā)生重排。關等[41]則切割了卵巢癌常規(guī)G顯帶中不能確定HSRs的染色體來源。通過與正常核型雜交確定了HSRs的染色體來源。這些選擇性擴增區(qū)域包括與卵巢癌相關的基因。作者共切割7個病例12個HSR，其中3例有19q13.1-q13.2擴增。已知AKT2是絲氨酸-蘇氨酸激酶基因，定位于19q13.1-q13.2，僅在UACC－326系中有AKT2基因擴增，卵巢癌基因侯選區(qū)還發(fā)現(xiàn)有4q16、15q15、15q22、q16q11-p13、2、16q21和16q24。關等通過顯微切割與比較基因組雜交克隆了乳腺癌在20q-q13.2位點的三個相關基因。
（5）克隆易位斷裂點
在人類惡性細胞中通達染色體易位已確定幾種重要的生長調(diào)節(jié)序列有關遺傳位點，如細胞癌基因和抑癌基因。Zhang等[42]確定了在惡性黑色素瘤基因中t(1;6）（q21;q14）的斷裂點，并切割了該裂點區(qū)域，建立DNA微克隆文庫，分離斷裂點附近Cosmid和YAC，鑒定出一跨斷裂點YAC。Muir等[43]則發(fā)現(xiàn)與頭裂畸形相關的平衡易位，這兩個斷裂點都將有助于克隆易感基因。
�。�6）確定多發(fā)斷裂點（斷裂熱點）
缺換6q為B淋巴胞瘤中最常見的一種染色體畸變。普通細胞遺傳學作圖分析和雜合性丟失（LOH）研究只檢測了幾個共同缺失區(qū)，而無法確定好發(fā)斷裂點。關等[44]切割了9例病人畸變的6號染色體。其中5例結(jié)果與G顯帶分析不同，未見末端缺失。4例近著絲粒缺失定位于6q11，1例在6q12，缺失遠端各異。其余4例有3例斷裂點在6q11,1例在6q12，故可確定斷裂熱點在6q11。關推測6q11染色體改變可能是影響一個與濾泡淋巴瘤相關基因。或僅僅是因獨特結(jié)構的一個胞性位點。
�、嘶蚨ㄎ缓突蚩寺�
外生性骨疣（EXT）Ⅰ型、Ⅱ型基因分別定位在8q24.1和11p11,其中EXT1已被克隆。鄧等[45]首次應用11p11顯微切割探針池篩選500000個克隆的骨胳肌cDNA文庫，得到12個陽性克隆，測序發(fā)現(xiàn)一個克隆與EXT1基因在總長度500bp的兩個區(qū)有58%和59%的相似，再以之為探針篩選人腦干和胎盤cDNA文庫,得到了EXT2基因的兩個轉(zhuǎn)錄本,從而克隆了該基因。人心臟河豚魚毒素耐受性電壓閘門Na+通道α-體亞單位基因（SCN5A）通過體細胞雜交定位于3號染色體上。Georage等[15]分別切割染色體3pter-q21，3p14-qter,3p22-qter,3pter-p22,3p21，再以SCN5A基因上特異性序列設計引物進行PCR確定SCN5A位于3p21�；蜃鲌D對于正確估價遺傳病綜合征的侯選基因很有價值，3號染色體上還存在有其它電壓依賴離子通道基因（CACNLIA2，定位于3p14.3），編碼確定α-亞單位二氫吡敏感性鈣通道，在腦和神經(jīng)內(nèi)分泌組織中表達，這對于3號染色體上其它電壓離了通道基因相關特異性分析很有幫助。Shelley等[16]通過人鼠雜種細胞板用PCR確定人β2基因內(nèi)含子的特定序列。為證實β2基因是否為5號染色體基因族的一個，分別切割5q32-q33與5q34-q35，用β2特異性引物擴增，5q34-q35出現(xiàn)198bp條帶，從而確定β2基因位于5q34-q35,這是通過原位雜交無法做到的。這對于同源基因定位非常有效。
(8)進化研究
Ambady等[26]切割豬6號染色體構成的探針池，與人的中期分裂相染色體進行染色體涂染，發(fā)現(xiàn)其與人1p和1q同源，從而通過種間比較可確定基因簇、數(shù)量線狀位點（quantitative trait loci,QTL）和進行其它物種基因的快速定位與克隆。
四、展望
染色體顯微切割技術是細胞遺傳學與分子遺傳學相結(jié)合的一種橋梁技術，結(jié)合其它技術，已在人類基因組工程與遺傳病等研究與應用中取得了不少的成果。由于其獨特的直接性，可減少污染，拓寬遺傳學研究范圍，如切割小昆蟲體細胞染色體，這是流式細胞分類等技術難以比擬的；構建全基因組區(qū)帶特異性cDNA文庫將對遺傳病致病基因的定位侯選克隆有所幫助；同源基因的精確定位也有了一種精確有效的方法。在對整個基因組結(jié)構、組成和功能進行進一步的研究中，染色體顯微鏡切割將發(fā)揮更為重要的作用。
湖南醫(yī)科大學醫(yī)學遺傳國家重點實驗室 作者：鄧昊 夏家輝審校
完成人類基因組計劃的全序列分析，需要構建基因高分辨遺傳圖譜和物理圖譜，如何快速有效的獲得染色體區(qū)帶特異性的序列標簽位點（STS）及表達序列標檢（EST），構建克隆連鎖群，分階段有序列的完成特定區(qū)帶全序列分析，染色體顯微切割技術顯示出無可比擬的優(yōu)越性。該技術自80年代初問世以來，通過與PCR、微克隆、FISH、DNA測序、文庫篩選、比較基因組雜交等分子生物學技術相結(jié)合，在染色病研究與診斷、文庫構建、基因定位與克隆、以及進化遺傳學與腫瘤遺傳學等方面的研究中取得了令人矚目的成績，并以其獨特的直接性和實用性保持其分子生物學領域良好的應用前景。
一、歷史回顧
1981年，德國的歐洲分子生物學實驗室（EMBL）Scalenghe等[1]切割了果蠅吃得開液腺多線期X染色體第3段的幾個片段，通過蛋白酶消化、酚抽提、EcoRI酶切進行重組克隆。1984年染色體顯微切割應用小氧，1986年Bates等[2]切割了人的2號染色體短臂。但當時由于所切割的染色體DNA量少，通常要切割上百條染色體，且其文庫也只含幾百個微克隆。顯微切割技術的第一閃重在突破在于它與PCR的結(jié)合，1989年Ludecke等[3]切割了人類G顯帶染色體，結(jié)合PCR技術進行體外擴增，使其工作量大大減小。鄧漢湘等[4]則創(chuàng)造性的設計了linker-priner粘端接頭，提高了連接效率，增高了文庫質(zhì)量。而1992年Melter等［5］在PCR擴增過程中引入簡并引物，在減少工作量的同時，還解決了探針片段受酶切位點限制、文庫不全和部分序列高度富集的現(xiàn)象，是染色體顯微切割領域的又一重大突破。
二、探針池或文庫質(zhì)量的控制
顯微切割是一項極其精細的工作，需要有熟練的技術和嚴格的防塵措施。通常一個好的文庫存至少覆蓋50%以上所切割的染色體區(qū)域，而且不應存在一些片段在PCR過程中的高度富集，才能保證以后研究中能分離較多的特異性DNA片段。污染的來源可以從以下幾個方面進行控制。
1.實驗試劑和用具
實驗操作臺要保持相對無菌，實驗操作人員要戴口罩。所用緩沖液應用0.22μM過濾器除菌，切割針對可用紫外線照射30分鐘或干熱滅菌。盡量使用一次性無菌用品。
2.染色體切割玻片的制備
雖然切割常規(guī)G帶片段通過FISH雜交得到陽性信號，甚至使用-20℃固定3年的細胞懸液制片也可能有滿意的結(jié)果[6]，但長時間的酸固定和暴露于空氣中可造成克隆插入子片段子[7，8]。Hagng等[9]為減少冰醋酸固定細胞引起DNA降解而采用速固定和乙醇洗脫。
3.切割方法的選擇
染色體顯微切割分手工切割和激光切割法[10～13]。前者較不常用，其方法是在倒置顯微鏡上裝配切割臂，安上硅化玻璃針，找到分散良好的分裂相來切割所需染色體片段。所切割染色體片段在油室中操作則操作繁瑣，而在Eppendorf管中操作污染較多。激光切割法分三步[4]：（1）自動澆灼：常規(guī)將所切割的染色體周圍核型及細胞核用激光澆灼；（2）手工澆灼：澆灼切割核型內(nèi)除切割區(qū)帶以外的染色體；（3）比率確定：精細切割區(qū)帶邊緣。激光能切割不太分散的分裂相，污染小，提高了成功率，但需要較高的設備條件，推廣較困難。
4.引物設計
染色體顯微切割引物分特異性引物和簡并引物。特異性引物有外源性和內(nèi)源性兩種。Ludecke等將內(nèi)切割片段克隆進puc載體，再用SamI酶切后puc上序列作特異性外源引物PCR擴增后將PCR產(chǎn)物克隆到puc13中，構建了染色體8q23-q24文庫�；蚨ㄎ粍t常用特異性內(nèi)源性引物[15，16]，即基因組DNA的一段特性性序列。簡并性引物以5%26acute;-CCGACTC-GAGNNNNNNATGTGG-3%26acute;(N=A,T,G,C各25%)[17]最為常用，它比六個簡并核苷酸置于3%26acute;末端[18]污染少，但簡并性效果差些。簡并的引物可自行擴增[19]造成探針池和文庫的質(zhì)量下降，但由于其操作簡單，免去酚仿抽提、連接等步驟，又能相對減少污染。Tokayama等采用簡并寡核引物穿梭PCR（Dop-shutter-PCR）提高了探針池的特異性。
5.PCR擴增周期
PCR大大減少了切割工作量，提高了成功率，甚至一個 dNA拷貝也能擴增成功[20]。但PCR擴增周期增加會導致文庫質(zhì)量下降，而FISH信號不一定減弱[21]。只要有某些片段在PCR中稍易擴增，就易引起這些片段的富集，Stefank等[18]在66個克隆中發(fā)現(xiàn)一個克隆出現(xiàn)8次。然而另一些資料顯示，由于簡并，PCR擴增呈序列非依賴性，甚至2kbDNA模板也可擴增出不同大小的片段，在瓊脂上無明顯條帶。
三、應用
隨著生命科學領域細胞分子水平研究的深入，染色體顯微切割在人、果蠅[1]、大鼠[22]、小鼠[23～25]、豬[26]等染色體研究中都有所應用，其應用價值和應用前景主要以有幾個方面。
1.染色體水平的研究
應用顯微切割構建的染色體特異性和染色體區(qū)帶特異性探針池，與可疑患者染色體進行正向染色體涂染[27]，或直接切割標記染色體，進行反向染色體涂染，可以用于研究標記染色體[28]，單體、三體、雙微體、易位、缺失[29]以及染色體均染區(qū)（HSR）的來源、結(jié)構和形成機制等。Tigand等[30]用顯微切割構建的區(qū)帶特異性探針池發(fā)現(xiàn)脊髓發(fā)育不良病人中有5q-;而Engelen等[31]發(fā)現(xiàn)了5個斷裂點的染色體復雜重排。染色體顯微切割在染色體病產(chǎn)前診斷[32]與產(chǎn)后分析中發(fā)揮了重要的作用[33]。
2.分子水平的研究
�。�1）構建染色體特異性和區(qū)帶異性文庫
染色體顯微切割、PCR得到的探針長度通常為150～1500bp，一般可以用來構建質(zhì)粒gDNA文庫[34]。而Hozier等[35]將cDNA原位雜交與染色體顯微切割結(jié)合起來，構建了鼠4號染色體C3-7區(qū)帶文庫。1996年 Yokoyama等[36]從胎腦mRNA反轉(zhuǎn)錄合成了第一鏈cDNA，再用兩步擴增法—Dop-shutter-PCR合成短片段cDNA，雜交于包括兩個近端著絲粒的K562細胞系中期分裂相，再切割標記染色體，發(fā)現(xiàn)81.5%克隆來源于所切割的相應區(qū)域，8個單拷貝序列中有5個是新的cDNA序列，僅1個來自于非切割區(qū)。應用顯微切割所構建的探針池也可通過文庫篩選快速分離區(qū)帶特異性文庫[37]Abdel等[38]則分離構建了包括700個Cosmid的12號染色體區(qū)帶特異性Cosmid亞文庫。
�。�2）構建整條染色體重疊群
關等[21]切割了人類6號染色體13個彼此相鄰的不同區(qū)帶探針池，由此構建了6號染色體重疊群。
�。�3）構建DNA圖譜
STS和EST為DNA制圖中一種重要的物理界標。人類基因組計劃原定目標是獲得分布于整個基因組約30000STS。使每隔100kb就有一個標記。Soejima等[39]通過顯微切割分離了11q13.4-q25的50個STS。而建立全基因組的基因圖，將加速對簡單孟德爾性狀基因的搜尋和對復雜性狀基因的認識，同時cDNA系列可以申請專利，這就激發(fā)了許多藥物公司對cDNA測序的興趣。用顯微切割構建cDNA區(qū)帶文庫，無論是DNA序列分析還是致病基因的定位侯選克隆都有深遠意義。
�。�4）染色體工勻染區(qū)（HSR）的研究
HSR是可見的基本擴增區(qū)，Xu等[40]發(fā)現(xiàn)在小細胞肺癌中11q13有基因擴增后再發(fā)生重排。關等[41]則切割了卵巢癌常規(guī)G顯帶中不能確定HSRs的染色體來源。通過與正常核型雜交確定了HSRs的染色體來源。這些選擇性擴增區(qū)域包括與卵巢癌相關的基因。作者共切割7個病例12個HSR，其中3例有19q13.1-q13.2擴增。已知AKT2是絲氨酸-蘇氨酸激酶基因，定位于19q13.1-q13.2，僅在UACC－326系中有AKT2基因擴增，卵巢癌基因侯選區(qū)還發(fā)現(xiàn)有4q16、15q15、15q22、q16q11-p13、2、16q21和16q24。關等通過顯微切割與比較基因組雜交克隆了乳腺癌在20q-q13.2位點的三個相關基因。
（5）克隆易位斷裂點
在人類惡性細胞中通達染色體易位已確定幾種重要的生長調(diào)節(jié)序列有關遺傳位點，如細胞癌基因和抑癌基因。Zhang等[42]確定了在惡性黑色素瘤基因中t(1;6）（q21;q14）的斷裂點，并切割了該裂點區(qū)域，建立DNA微克隆文庫，分離斷裂點附近Cosmid和YAC，鑒定出一跨斷裂點YAC。Muir等[43]則發(fā)現(xiàn)與頭裂畸形相關的平衡易位，這兩個斷裂點都將有助于克隆易感基因。
�。�6）確定多發(fā)斷裂點（斷裂熱點）
缺換6q為B淋巴胞瘤中最常見的一種染色體畸變。普通細胞遺傳學作圖分析和雜合性丟失（LOH）研究只檢測了幾個共同缺失區(qū)，而無法確定好發(fā)斷裂點。關等[44]切割了9例病人畸變的6號染色體。其中5例結(jié)果與G顯帶分析不同，未見末端缺失。4例近著絲粒缺失定位于6q11，1例在6q12，缺失遠端各異。其余4例有3例斷裂點在6q11,1例在6q12，故可確定斷裂熱點在6q11。關推測6q11染色體改變可能是影響一個與濾泡淋巴瘤相關基因。或僅僅是因獨特結(jié)構的一個胞性位點。
�、嘶蚨ㄎ缓突蚩寺�
外生性骨疣（EXT）Ⅰ型、Ⅱ型基因分別定位在8q24.1和11p11,其中EXT1已被克隆。鄧等[45]首次應用11p11顯微切割探針池篩選500000個克隆的骨胳肌cDNA文庫，得到12個陽性克隆，測序發(fā)現(xiàn)一個克隆與EXT1基因在總長度500bp的兩個區(qū)有58%和59%的相似，再以之為探針篩選人腦干和胎盤cDNA文庫,得到了EXT2基因的兩個轉(zhuǎn)錄本,從而克隆了該基因。人心臟河豚魚毒素耐受性電壓閘門Na+通道α-體亞單位基因（SCN5A）通過體細胞雜交定位于3號染色體上。Georage等[15]分別切割染色體3pter-q21，3p14-qter,3p22-qter,3pter-p22,3p21，再以SCN5A基因上特異性序列設計引物進行PCR確定SCN5A位于3p21�；蜃鲌D對于正確估價遺傳病綜合征的侯選基因很有價值，3號染色體上還存在有其它電壓依賴離子通道基因（CACNLIA2，定位于3p14.3），編碼確定α-亞單位二氫吡敏感性鈣通道，在腦和神經(jīng)內(nèi)分泌組織中表達，這對于3號染色體上其它電壓離了通道基因相關特異性分析很有幫助。Shelley等[16]通過人鼠雜種細胞板用PCR確定人β2基因內(nèi)含子的特定序列。為證實β2基因是否為5號染色體基因族的一個，分別切割5q32-q33與5q34-q35，用β2特異性引物擴增，5q34-q35出現(xiàn)198bp條帶，從而確定β2基因位于5q34-q35,這是通過原位雜交無法做到的。這對于同源基因定位非常有效。
(8)進化研究
Ambady等[26]切割豬6號染色體構成的探針池，與人的中期分裂相染色體進行染色體涂染，發(fā)現(xiàn)其與人1p和1q同源，從而通過種間比較可確定基因簇、數(shù)量線狀位點（quantitative trait loci,QTL）和進行其它物種基因的快速定位與克隆。
四、展望
染色體顯微切割技術是細胞遺傳學與分子遺傳學相結(jié)合的一種橋梁技術，結(jié)合其它技術，已在人類基因組工程與遺傳病等研究與應用中取得了不少的成果。由于其獨特的直接性，可減少污染，拓寬遺傳學研究范圍，如切割小昆蟲體細胞染色體，這是流式細胞分類等技術難以比擬的；構建全基因組區(qū)帶特異性cDNA文庫將對遺傳病致病基因的定位侯選克隆有所幫助；同源基因的精確定位也有了一種精確有效的方法。在對整個基因組結(jié)構、組成和功能進行進一步的研究中，染色體顯微鏡切割將發(fā)揮更為重要的作用。
湖南醫(yī)科大學醫(yī)學遺傳國家重點實驗室 作者：鄧昊 夏家輝審校
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