一、 前言[1，2]
基因工程已令人難以置信的擴(kuò)展了我們關(guān)于有機(jī)體DNA序列的認(rèn)識(shí)。但是仍有許多新識(shí)別的基因的功能還不知道，也不知道基因產(chǎn)物是如何相互作用從而產(chǎn)生活的有機(jī)體的。功能基因組試圖通過(guò)大規(guī)模實(shí)驗(yàn)方法來(lái)回答這些問(wèn)題。但由于僅從DNA序列尚不能回答某基因的表達(dá)時(shí)間、表達(dá)量、蛋白質(zhì)翻譯后加工和修飾的情況、以及它們的亞細(xì)胞分布等等，因此在整體水平上研究蛋白質(zhì)表達(dá)及其功能變得日益顯得重要。這些在基因組中不能解決的問(wèn)題可望在蛋白質(zhì)組研究中找到答案。蛋白質(zhì)組研究的數(shù)據(jù)與基因組數(shù)據(jù)的整合，將會(huì)在后基因組研究中發(fā)揮重要作用。
目前蛋白質(zhì)組研究采用的主要技術(shù)是雙向凝膠電泳和質(zhì)譜方法。雙向凝膠電泳的基本原理是蛋白質(zhì)首先根據(jù)其等電點(diǎn)，第一向在pH梯度膠內(nèi)等電聚焦，然后轉(zhuǎn)90度按他們的分子量大小進(jìn)行第二向的SDS-PAGE分離。質(zhì)譜在90年代得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，生物質(zhì)譜當(dāng)上了主角，蛋白質(zhì)組學(xué)又為生物質(zhì)譜提供了一個(gè)大舞臺(tái)。他們中首選的是MALDI-TOF，其分析容量大，單電荷為主的測(cè)定分子量高達(dá)30萬(wàn)，干擾因素少，適合蛋白質(zhì)組的大規(guī)模分析。其次ESI為主的LC-MS聯(lián)機(jī)適于精細(xì)的研究。本文將簡(jiǎn)介幾種常用的生物質(zhì)譜技術(shù)，并著重介紹生物質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用。

二、 生物質(zhì)譜技術(shù)[3，4]
1．電噴霧質(zhì)譜技術(shù)（ESI）[5]
電噴霧質(zhì)譜技術(shù)( Electrospray Ionization Mass Spectrometry , ESI - MS)
是在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓,所產(chǎn)生的高電場(chǎng)使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴,隨著溶劑蒸發(fā),液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大,最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子,致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子,
使質(zhì)量電荷比(m/ z) 降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測(cè)的范圍,因而大大擴(kuò)展了分子量的分析范圍,離子的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。

2．基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)（MOLDI）[5-7]
基質(zhì)輔助激光解析電離（MOLDI）是由德國(guó)科學(xué)家Karas和Hillenkamp發(fā)現(xiàn)的。將微量蛋白質(zhì)與過(guò)量的小分子基體的混合液體點(diǎn)到樣品靶上，經(jīng)加熱或風(fēng)吹烘干形成共結(jié)晶，放入離子源內(nèi)。當(dāng)激光照射到靶點(diǎn)上時(shí)，基體吸收了激光的能力躍遷到激發(fā)態(tài)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)電離和汽化，電離的結(jié)果通常是基體的質(zhì)子轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)上。然后由高電壓將電離的蛋白質(zhì)從離子源轉(zhuǎn)送到質(zhì)量分析器內(nèi)，再經(jīng)離子檢測(cè)器和數(shù)據(jù)處理得到質(zhì)譜圖。TOF質(zhì)量分析器被認(rèn)為是與MALDI的最佳搭配，因?yàn)槎�者都是脈沖工作方式，在質(zhì)量分析過(guò)程中離子損失很少，可以獲得很高的靈敏度。TOF質(zhì)量分析器結(jié)果簡(jiǎn)單，容易換算，蛋白質(zhì)離子在飛行管內(nèi)的飛行速度僅與他的(m/z)-1/2成正比，因此容易通過(guò)計(jì)算蛋白質(zhì)離子在飛行管內(nèi)的飛行時(shí)間推算出蛋白質(zhì)離子的m/z值。與傳統(tǒng)質(zhì)量分析器相比，更易得到高分辨率和高測(cè)量精度；速度快，離子飛行時(shí)間僅為幾個(gè)μs和約100μs之間；質(zhì)量范圍寬，可以直接檢測(cè)到幾十萬(wàn)道爾頓的單電荷離子。飛行時(shí)間質(zhì)量分析器被認(rèn)為是21世紀(jì)最有應(yīng)用前景的質(zhì)量分析器。

3．傅立葉變換－離子回旋共振質(zhì)譜（FT-ICR MS）[8，9]
傅立葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜法(FT-ICR
MS)是離子回旋共振波譜法與現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物。傅立葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜法是基于離子在均勻磁場(chǎng)中的回旋運(yùn)動(dòng),
離子的回旋頻率、半徑、速度和能量是離子質(zhì)量和離子電荷及磁場(chǎng)強(qiáng)度的函數(shù), 當(dāng)對(duì)離子施加與其回旋頻率相同的射頻場(chǎng)作用時(shí), 離子將同相位加速到一較大的半徑回旋,
從而產(chǎn)生可被接受的類似電流的信號(hào)。傅立葉變換-離子回旋共振質(zhì)譜法所采用的射頻范圍覆蓋了欲測(cè)定的質(zhì)量范圍,所有離子同時(shí)被激發(fā), 所檢測(cè)的信號(hào)經(jīng)過(guò)傅立葉變換,
轉(zhuǎn)換為質(zhì)譜圖。其主要優(yōu)點(diǎn)有：容易獲得高分辨；便于實(shí)現(xiàn)串極質(zhì)譜分析；便于使用外電離源并與色譜儀器聯(lián)用。此外，他還有靈敏度高，質(zhì)量范圍寬，速度快，性能可靠等優(yōu)點(diǎn)。

4．快原子轟擊質(zhì)譜技術(shù)（FABMS）
快原子轟擊質(zhì)譜技術(shù)( Fast Atom Bomebardment Mass Spectrometry , FABMS)
是一種軟電離技術(shù),是用快速惰性原子射擊存在于底物中的樣品,使樣品離子濺出進(jìn)入分析器,這種軟電離技術(shù)適于極性強(qiáng)、熱不穩(wěn)定的化合物的分析,特別適用于多肽和蛋白質(zhì)等的分析研究。FABMS能提供有關(guān)離子的精確質(zhì)量,從而可以確定樣品的元素組成和分子式。而FABMS
-MS 串聯(lián)技術(shù)的應(yīng)用可以提供樣品較為詳細(xì)的分子結(jié)構(gòu)信息,從而使其在生物醫(yī)學(xué)分析中迅速發(fā)展起來(lái)。
三、蛋白質(zhì)的分析鑒定[3, 4, 10]
隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，分子量的測(cè)定已從傳統(tǒng)的有機(jī)小分子擴(kuò)展到了生物大分子。MALDI-MS技術(shù)以其極高的靈敏度、精確度在蛋白質(zhì)分析中得到了廣泛的應(yīng)用。該技術(shù)不僅可測(cè)定各種疏水性、親水性和糖蛋白的分子量，還可直接測(cè)定蛋白質(zhì)混合物的分子量。這可認(rèn)為是蛋白質(zhì)分析領(lǐng)域的一項(xiàng)重大突破。
蛋白質(zhì)組的研究是從整體水平上研究細(xì)胞或有機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的組成及其活動(dòng)規(guī)律。質(zhì)譜技術(shù)作為蛋白質(zhì)組研究的三大支撐技術(shù)之一，除了用于多肽，蛋白質(zhì)的分子量測(cè)定外，還廣泛的應(yīng)用于肽指紋圖譜測(cè)定及氨基酸序列測(cè)定。
肽指紋圖譜(Peptide Mass Fingerprinting,
PMF)測(cè)定是對(duì)蛋白酶解或降解后所得多肽混合物進(jìn)行質(zhì)譜分析的方法。質(zhì)譜分析所得肽斷與多肽蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)的理論肽斷進(jìn)行比較，判斷出所測(cè)蛋白是已知還是未知。由于不同的蛋白質(zhì)具有不同的氨基酸序列，不同蛋白質(zhì)所得肽斷具有指紋特征。采用肽指紋譜的方法已對(duì)酵母、大腸桿菌、人心肌等多種蛋白質(zhì)組進(jìn)行了研究。
對(duì)肽序列的測(cè)定往往要應(yīng)用串連質(zhì)譜技術(shù)，采用不同的技術(shù)選擇特定質(zhì)核比的離子，并對(duì)其進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，通過(guò)分析肽段的斷裂情況推導(dǎo)出肽序列。

四、后轉(zhuǎn)錄修飾的蛋白質(zhì)的檢測(cè)和識(shí)別
在蛋白質(zhì)組的研究中，蛋白質(zhì)和多肽的序列分析已不局限于闡明蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)翻譯后的修飾的進(jìn)一步分析也是蛋白質(zhì)化學(xué)的一項(xiàng)重要任務(wù)。這種修飾對(duì)于蛋白質(zhì)的功能非常重要，如：細(xì)胞識(shí)別中的蛋白質(zhì)相互作用，信號(hào)傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)定位。
1． 蛋白質(zhì)的糖基化[11, 12]
糖蛋白在細(xì)胞內(nèi)部，細(xì)胞膜和細(xì)胞外均有發(fā)現(xiàn)，實(shí)際上大部分蛋白質(zhì)是糖蛋白。對(duì)糖蛋白的檢測(cè)和分析發(fā)現(xiàn)，糖蛋白中糖組分的結(jié)構(gòu)和功能具有多樣性。糖蛋白中的糖通常是不同種類的，而且是由一些可控?cái)?shù)量的單糖組成。糖基化的多樣性與細(xì)胞周期，細(xì)胞分化和發(fā)展的狀態(tài)有關(guān)。在蛋白組時(shí)代中，蛋白質(zhì)的修飾會(huì)引起其理化性質(zhì)的改變，因此是不容忽視的。
從1D或2D凝膠得到的糖基化蛋白的識(shí)別，一般是進(jìn)行MALDI-MS指紋分析，
或是對(duì)MALDI-PAD或ESI-MS/MS得到的碎片譜進(jìn)行分析。對(duì)完整的糖蛋白的研究是非常困難的，所有已知的離子化技術(shù)都有其局限性。目前，人們主要研究糖肽，其好處之一就是質(zhì)量減小了，這就會(huì)得到更好的分辨率，而且糖肽仍保留了糖基化位點(diǎn)。將分離的糖蛋白用不同的蛋白酶消化后就可進(jìn)行糖肽的研究。一旦糖肽被識(shí)別出，就可以用串連質(zhì)譜(ESI-MS/MS)來(lái)闡明肽序列。當(dāng)?shù)鞍椎男蛄幸阎獣r(shí)，計(jì)算質(zhì)量差就可推出其上附著的寡糖的質(zhì)量。
要將糖部分從糖蛋白中釋放出來(lái)，可用化學(xué)切割或酶切割（流程圖見(jiàn)圖1）。目前，連有結(jié)構(gòu)專一性糖苷酶的質(zhì)譜在提供序列，分支和鏈接數(shù)據(jù)方面是最有力的技術(shù)。對(duì)于N糖基化常用的糖苷內(nèi)切酶有PNGase-F,
PNGase-A,
EndoF和EndoH�；瘜W(xué)切割也可以用來(lái)釋放O-連接和N-連接的多糖，但經(jīng)常出現(xiàn)的缺點(diǎn)是他會(huì)完全破壞所有的肽鍵，因而丟失了關(guān)于糖附著位點(diǎn)的信息。而且這些切割不能從糖肽中連續(xù)釋放單糖。用肼的化學(xué)切割可以除去兩種類型的糖基化。在60℃可專一性的釋放O-連接的糖，而在95℃能釋放N-連接的糖。釋放O-原子更常用的方法是用堿進(jìn)行β消除。通常，糖基中加入金屬離子在MALDI和ESI中離子化。用MALDI-MS分析糖類的一個(gè)好的選擇是將之與其他一些化合物混合，這樣可以進(jìn)一步提高靈敏度和分辨率。不同的質(zhì)譜方法可以產(chǎn)生多糖的源后裂解(PSD)和碰撞誘導(dǎo)解離
(CID)譜，這可以給出有關(guān)糖的序列，分支及糖間的連接等信息。

2． 蛋白質(zhì)的磷酸化[13, 14]
蛋白質(zhì)中氨基酸的磷酸化在生命系統(tǒng)中起重要的作用。磷酸化經(jīng)常作為分子開關(guān)控制不同過(guò)程蛋白質(zhì)的活性，如新陳代謝，信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞分裂等過(guò)程。因此，蛋白質(zhì)中磷酰氨基酸的識(shí)別在蛋白質(zhì)分析中是一項(xiàng)重要的工作。已知的磷酰氨基酸的類型有四種：
1．O-磷酸鹽，通過(guò)羥氨酸的磷酸化形成的，如絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸。
2．N-磷酸鹽，通過(guò)精氨酸，賴氨酸或組氨酸中的氨基的磷酸化形成的。
3．乙酰磷酸鹽，通過(guò)天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的。
4．S-磷酸酯，通過(guò)半胱氨酸的磷酸化形成的。
用質(zhì)譜分析磷酸化時(shí)主要存在的問(wèn)題是，混合物中磷酸化肽的信號(hào)被抑制。因此只有當(dāng)一些非磷酸化肽的含量降低(或磷酸化的肽被富集)后,
分析磷酸化的肽才會(huì)變得容易些。一些相應(yīng)的用于質(zhì)譜分析的前磷酸化肽或磷酸化蛋白質(zhì)的分離和富集方法和技術(shù)已有所發(fā)展，現(xiàn)已建立的分離技術(shù)有：雙向磷酸多肽譜圖(2D-PP)，高分辨率的凝膠電泳(2DE)和反相高效液相色譜(RP-HPLC)。對(duì)于32P標(biāo)記的磷酸化肽或蛋白可用放射自顯影或磷儲(chǔ)屏檢測(cè)，提取后可以高靈敏度MALDI-MS分析；如果32P標(biāo)記不可行，就要用LC-MS/MS分析，常用HPLC與質(zhì)譜聯(lián)用。
 
常用的富集方法有：固定金屬親和色譜(IMAC)，IMAC是選擇性分離和富集磷酸化肽最廣泛的方法。此方法中,
鍵合在螯合底物上的金屬離子(通常是Fe3+或Ga3+)選擇性地與磷酸化肽中的磷酸部分相結(jié)合, 并且在高pH
或磷酸緩沖液中磷酸化肽可以釋放出來(lái)�？贵w免疫沉淀，高親和性抗體可以從復(fù)雜混合物中免疫沉淀特定的蛋白。目前利用抗體富集蛋白/肽僅局限于分析磷酸化酪氨酸,
然后用MALDI－TOF MS分析與抗體相聯(lián)接的磷酸化肽。盡管用于免疫沉淀的抗體對(duì)其底物必須有相對(duì)高的親和力,
但低親和力抗體仍然可以有效地用于免疫印跡Western-blotting分析�；瘜W(xué)修飾，已建立了兩種從復(fù)雜混合物中專一分離磷酸化蛋白/肽的方法[15,16]。但兩種方法都有待進(jìn)一步優(yōu)化以鑒定低豐度蛋白質(zhì)。
磷酸化肽的檢測(cè)和磷酸化位點(diǎn)的確定主要有以下MS技術(shù)：MALDI-TOF MS
可以通過(guò)肽指紋譜(PMF)鑒定蛋白質(zhì)，與磷酸酯酶處理相結(jié)合可以確定磷酸化位點(diǎn)。其原理是磷酸酯酶處理后，磷酸化的肽丟失磷酸基團(tuán)而產(chǎn)生特定質(zhì)量數(shù)的變化，MALDI-TOF
MS通過(guò)檢測(cè)這種質(zhì)量數(shù)的變化而確定磷酸化位點(diǎn)。串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)
可進(jìn)行前體離子掃描，這一方法是通過(guò)檢測(cè)磷酸基團(tuán)產(chǎn)生的特定片段來(lái)報(bào)告磷酸肽的存在。磷酸化肽經(jīng)CID后會(huì)產(chǎn)生磷酸基團(tuán)的特異性片段，這些特異性的片段在用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行前體離子掃描時(shí)可作為磷酸肽的“報(bào)告離子”。串聯(lián)質(zhì)譜還可進(jìn)行中性丟失掃描，這種方法是用MS/MS檢測(cè)經(jīng)CID后發(fā)生中性丟失H3PO4
(98 u)的肽段。另外，由于液相色譜分離肽降低了離子抑制效應(yīng)，也有人用LC-MS/MS分析磷酸化位點(diǎn)。傅立葉變換質(zhì)譜進(jìn)行電子捕獲解離
電子捕獲解離(ECD)與傅立葉變換離子回旋加速共振(FTICR)質(zhì)譜相連是蛋白質(zhì)、肽測(cè)序和研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一個(gè)有力方法。近來(lái)，它已被成功地用于鑒定肽片段上發(fā)生磷酸化的殘基。

五、 小結(jié)
目前,生物質(zhì)譜被認(rèn)為是大規(guī)模、高通量進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)鑒定的首選工具,但與之結(jié)合的2-D電泳仍有缺點(diǎn),如工作量大,重現(xiàn)性差。因此,將對(duì)其進(jìn)行改進(jìn),如分子掃描技術(shù)等。由于通過(guò)LC-MS/MS可直接鑒定蛋白混合物,因此將來(lái)有望不通過(guò)2-D
就能研究蛋白質(zhì)組。當(dāng)然,這還需要解決一些技術(shù)問(wèn)題,其中最根本的是質(zhì)譜的定量問(wèn)題。生物質(zhì)譜的魅力在于它能幫助我們研究蛋白-
蛋白間相互作用、翻譯后修飾乃至基因表達(dá)水平的變化等。相信,隨著生物質(zhì)譜技術(shù)和數(shù)據(jù)采集軟件技術(shù)的不斷飛速發(fā)展,我們將能夠獲得這方面的更多信息,從而揭示出生命活的奧秘。
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