激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscope LSCM )是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項具有劃時代意義的高科技新產(chǎn)品，是當(dāng)今世界最先進(jìn)的細(xì)胞生物學(xué)分析儀器。它是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上加裝激光掃描裝置，使用紫外光或可見光激發(fā)熒光探針，利用計算機(jī)進(jìn)行圖象處理，對生物樣品進(jìn)行定性、定量、定時和定位研究。已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、生理學(xué)、病理學(xué)、解剖學(xué)、胚胎學(xué)、免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等領(lǐng)域。

一. 組成
倒置或直立熒光顯微鏡、掃描頭(照明針孔、探測針孔、熒光濾片系統(tǒng)、鏡掃描系統(tǒng)和光電倍增管)、掃描頭控制電路、計算機(jī)和圖像輸出設(shè)備

二. 原理
Confocal
利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現(xiàn)點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。計算機(jī)以像點的方式將被探測點顯示在計算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。

三. 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點:
1.點照明
2.具有照明pinhole和探測pinhole
3.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦), 共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面
4.具有掃描系統(tǒng)―― 逐點掃描成像
5.具有多個（四個） 熒光通道，可同時探測多個被標(biāo)記物
例如: Leica TCS NT 的技術(shù)指標(biāo):
1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x
傳統(tǒng)顯微鏡: Rxy=0.61l/NA
Confocal: Rxy=0.4l/NA
2. 樣品的最大厚度:大約 2mm(10X/0.2物鏡)
取決于三點:
物鏡的景深, 與NA成反比
Z軸的最大移動范圍
激光的穿透力
3. 樣品的最小光切厚度: 大約0.35 mm
取決于兩點: 物鏡的數(shù)值孔徑NA
Z軸的最小移動步距: 40nm
Z軸的分辨率: 0.35 mm
4. 激光器
Kr/Ar激光器: 477nm, 488nm, 568nm, 647nm
Ar激光器(UV): 361nm
激光器的特點:
1) 方向性好: 激光基本眼直線傳播
2) 單色性好 l=10-8nm
3) 高亮度: 激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度集中的
4) 偏振性: 激光為平面偏振光, 光纖耦合
5. 四個熒光通道, 一個透射光通道, 即除了可同時采集
多標(biāo)記熒光圖像外還可以同時采集透射光圖像,但透
射光圖像為非共焦圖像

四. 共焦顯微鏡的類型：
1.點(慢)掃描共焦顯微鏡: 分辨率高, 圖像清晰;
噪音低;
采集圖像速度慢;
目鏡中觀察不到共焦圖像;
2.線(狹縫)掃描共焦 顯微鏡(video rate): 分辨率低;
噪音高;
掃描速度快 240幅/秒;
目鏡中可觀察到共焦圖像
3.Nipkov轉(zhuǎn)盤式掃描共焦顯微鏡: 性能介于上述兩者之間
功能:1.多熒光標(biāo)記樣品的圖像采集
2.無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”
3.真正的三維重組
4.假三維圖的顯示
5.可沿Z軸（xy平面）和Y軸（xz平面）方向進(jìn)行光切
6.定量分析
7.xyt 、xzt、xyzt 和 xt 掃描―― 時間序列掃描
8.圖像處理
9. 旋轉(zhuǎn)掃描
10.區(qū)域掃描
11.光譜掃描

五、激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用
定位、定量
三維重組
動態(tài)測量
*活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca2+濃度的測量
*活細(xì)胞內(nèi)H+濃度（ pH值）的測量
*自由基的檢測
*藥物進(jìn)入細(xì)胞的動態(tài)過程、定位分布及定量
應(yīng)用：細(xì)胞膜電位的測量
熒光漂白恢復(fù)（FRAP）的測量
籠鎖解籠鎖的測量
熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）的測量

其他應(yīng)用
1、定位、定量
免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三 標(biāo)）的定位、定量。如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布，
微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋白的共存與共定位、蛋白與細(xì)胞器的共定位
細(xì)胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位雜交-fitc + PI
熒光原位雜交： 染色體基因定位
單細(xì)胞凝膠電泳
GFP的表達(dá)
游離Ca2+ 的分布與定量
定位、定量研究中常用熒光探針
1）Amine-Reactive Probes與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等
2）FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/512
3）異硫氰基熒光素 494/518
4）TRITC 四甲基異硫氰基羅丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569
5）Texas Red 德州紅 595/615 BODIPY TR592/618
6）PE 藻紅蛋白 565/578
7）cy3 490/530
8）cy5 650/690

(1)細(xì)胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白
免役熒光標(biāo)記： 與抗體耦聯(lián),
直標(biāo): 一抗+熒光探針
間標(biāo): 二抗+熒光探針 如: 微管蛋白 抗 tublin抗體+熒光探針 肌動蛋白 Palloidine+熒光探針

(2)細(xì)胞膜表面受體
配體+熒光探針 如: nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2)
標(biāo)記 Gm1: 霍亂毒素受體 霍亂毒素+FITC

2.標(biāo)記細(xì)胞器熒光探針
(1)線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細(xì)胞，陽離子性,可檢測線粒體膜電位, 且在多數(shù)細(xì)胞中停留時間短
JC1 線粒體膜電位低時為單體 490/527 發(fā)綠光
線粒體膜電位低時為多聚體 490/590 發(fā)紅光
可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體，且為檢測線粒體膜電
位最佳探針: Mitotracker Green FM 490/516, 染活細(xì)胞或固定細(xì)胞 ,
穩(wěn)定不漏出: Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 還原型, 只能染活細(xì)胞
(2)溶酶體 Lysosome中性紅 541/640: 微偏堿性, 可標(biāo)記溶酶體等酸性器官為非特異性
AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細(xì)胞 LysoTracker Blue LysoTracker
Red
(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性, 較高濃度標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng),較低濃度標(biāo)記線粒體
(4)高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細(xì)胞 ¨細(xì)胞器的單克隆抗體
(5)細(xì)胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死細(xì)胞
碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細(xì)胞
Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞
Hochest 33258 (同上)
DAPI 358/461 DNA A-T 半通透細(xì)胞
Chromomycin A3 450/470 DNA G-C
AO 500/526 DNA 活細(xì)胞
460/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死細(xì)胞
SYTO 活細(xì)胞

3. GFP 綠色熒光蛋白
GFP的的發(fā)現(xiàn)：60年代，Shimomura等首先從水母中分離出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白
GFP, 后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFP在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光。將外源基因與GFP DNA
相連, GFP可作為外源基因的報告基因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達(dá).
GFP主要應(yīng)用: 對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動態(tài)觀察
如: 可實時原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中的時空表達(dá)
GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞, 可動態(tài)觀察該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程
GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連,就能顯示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的
結(jié)構(gòu)及病理過程:定位與定量測量應(yīng)注意的問題
定位：1.可以對圖像進(jìn)行修飾，
2.pinhole 可盡可能的小。
3.確認(rèn)共定位時要取兩個通道熒光相互干擾的對照圖像

定量：
1.儀器的各個條件必須一致
2.必須用原始圖像進(jìn)行定量測量
3.Pinhole盡可能的大

六.顯微CT與三維重組
光切的層數(shù)：VoxelsizeZ £ 2VoxelsizeX
七.動態(tài)測量 Physiology:細(xì)胞內(nèi)離子動態(tài)變化測量
1).游離Ca2+測量
檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10xkd,
Kd和很多因素有關(guān)，如pH、 Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值(10-100n
M)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）
熒光探針 激發(fā)波長 發(fā)射波長 Kd
FLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM
Fluo4 506nm 525nm
Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM
Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM
Fura red 420/480nm 637nm 140nM
Oregon Green 488 494nm 520nm 20,000nM
Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM
Indo-1 356nm 405/458nm 230nM
Fura-2 340/380 476nm 145nM

相對測量
DF/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)
Ca2+濃度絕對測量
單波長公式法
Fluo3: 530nm Kd=450nM
[Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)
Fmin: 細(xì)胞內(nèi)無鈣時的熒光強(qiáng)度( MnCl2)
Fmax：細(xì)胞內(nèi)鈣飽和時的熒光強(qiáng)度(A23187)
測量時切記細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的相對熒光強(qiáng)度值不能太低（F值不低于40）
細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M）
細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）
標(biāo)準(zhǔn)曲線法：根據(jù)儀器條件和負(fù)載條件，以不同Ca2+濃度的Buffer(EGTA-
Ca2+)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫軸為Ca2+濃度，縱軸為熒光強(qiáng)度
比例熒光的測量：雙波長(比例熒光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380,
440)[Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2

細(xì)胞器的Ca2+測量
1.線粒體內(nèi)游離Ca2+測量 Fluo-3 + TMRM(線粒體熒光探針，紅色）
2. 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白 水母發(fā)光蛋白與 Ca2+結(jié)合后發(fā)藍(lán)光
用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細(xì)胞器蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可測定亞細(xì)胞器內(nèi)的游離Ca2+變化目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核內(nèi)的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能使用Confocal
檢測

細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+測量的應(yīng)用：
鈣的特性
1．細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度103-104倍
2．細(xì)胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣明顯升高
3．細(xì)胞內(nèi)鈣為細(xì)胞激活“開關(guān)”

細(xì)胞內(nèi)鈣的生理作用
1．肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián)
2．神經(jīng)遞質(zhì)的釋放
3．學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng)
4．卵子受精
5．細(xì)胞分裂和再生
6．細(xì)胞調(diào)亡
7．細(xì)胞間通訊
8．細(xì)胞信號傳導(dǎo)
9. DNA合成

10. 基因表達(dá)
細(xì)胞內(nèi)鈣超載與疾病
1．高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病―胞內(nèi)鈣濃度異常
2．糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病―胞內(nèi)鈣濃度增高
3．人體缺鈣―骨鈣大量丟失，神經(jīng)細(xì)胞的鈣濃度增高
4．老化和老年性癡呆-神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高
細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M），細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）

八.熒光漂白恢復(fù)(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching)
定義:經(jīng)熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞的某一區(qū)域一旦被高強(qiáng)度的激光照射后,熒光物質(zhì)的光化學(xué)結(jié)構(gòu)被迫壞,熒光強(qiáng)度下降, 且為不可逆的過程, 但此處熒光強(qiáng)度會漸漸恢復(fù),
熒光強(qiáng)度和恢復(fù)的快慢和多少,代表周圍分子擴(kuò)散的速率, 或分子運(yùn)動速度。
R=(I2-I1 /I0-I2)100%
R-熒光漂白恢復(fù)率：代表分子的運(yùn)動速度
應(yīng)用：細(xì)胞間通訊， 細(xì)胞膜流動性，蛋白分子的運(yùn)動

九.籠鎖解籠鎖的測量
定義：籠鎖化合物全稱為光致不穩(wěn)定籠鎖化合物，為人工合成的用隱蔽基團(tuán)修飾生物活性分子的化合物，一旦被紫外光照射，兩者間的共價鍵幾解離而釋放出活性分子，這一光解作用稱為解籠鎖。
籠鎖化合物的種類：籠鎖的神經(jīng)遞質(zhì)、籠鎖的第二信使、籠鎖鈣等

十．熒光能量共振轉(zhuǎn)移( fluorescence Resonance Energy
Transfer)能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個部位向另一個部位的傳遞，或能量從一個分子向另一個分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。
能量共振轉(zhuǎn)移：分子可以看作為正負(fù)電荷分離的一個偶極子，受激發(fā)以一定的頻率振動，如果其附近有一個振動頻率相同的另一分子存在，則通過這兩個分子之間的偶極-偶極相互作用，能量可以非輻射方式從前者轉(zhuǎn)移到后者，這種能量轉(zhuǎn)移稱為共振轉(zhuǎn)移。
熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件
兩個熒光分子：供體-FL1，受體-FL2供體與受體的距離在2-7nm，供體的發(fā)射波長與受體的激發(fā)波長一致
檢測：
以FL1的激發(fā)波長的光照射樣品，沒有共振轉(zhuǎn)移時，只檢測到FL1的發(fā)射光(綠光)，發(fā)生共振轉(zhuǎn)移時，就可檢測出FL1的熒光(綠光)減弱，F(xiàn)L2(紅光)的增強(qiáng)。
應(yīng)用：檢測大分子的相互作用
大分子構(gòu)象的改變(蛋白)，例：大分子(亞基)的結(jié)合與分離受體與配體的結(jié)合 ，常用熒光探劑：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP

十一 .其它應(yīng)用
生物材料,例: 細(xì)胞在生物材料中的生長狀態(tài)及分布

激光掃描共焦顯微鏡的發(fā)展趨勢：
連續(xù)光譜型Confocal
多光子激光掃描顯微鏡