上�；菡\(chéng)生物提供的RAA和RT-RAA擴(kuò)增試劑是基于重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增（Recombinase-aid Amplification，RAA）技術(shù)開發(fā)的恒溫核酸擴(kuò)增檢測(cè)試劑，在39～42℃恒溫條件下特異識(shí)別并擴(kuò)增目標(biāo)樣本的核酸片段，可配合電泳法、實(shí)時(shí)熒光或通用型核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)判斷。

可試用產(chǎn)品：2023年6月1日到9月30日

HP80201 基礎(chǔ)型RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

HP80202 熒光型RAA 核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

HP80203 基礎(chǔ)型RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

HP80204 熒光型RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

HP80205 試紙條型RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

HP80206 試紙條型RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）

儲(chǔ)存及有效期

本產(chǎn)品存儲(chǔ)于2~28℃、干燥、避光條件下，有效期為12 個(gè)月。

產(chǎn)品用途

RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）可應(yīng)用于核酸DNA 的快速擴(kuò)增。

RT-RAA核酸擴(kuò)增試劑（凍干顆粒）可應(yīng)用于核酸RNA的快速擴(kuò)增。

技術(shù)原理

重組酶介導(dǎo)鏈置換核酸擴(kuò)增（Recombinase-aid Amplification，RAA），是一種恒溫核酸快速擴(kuò)增技術(shù)。RT-RAA先利用逆轉(zhuǎn)錄酶將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，從細(xì)菌或真菌中獲得的重組酶在常溫下可與引物DNA緊密結(jié)合，形成重組酶/引物復(fù)合體，侵入RNA-cDNA雙鏈核酸模板，在侵入位點(diǎn)重組酶將雙鏈打開，同時(shí)單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合到被重組酶打開的單鏈上，維持雙鏈模板處于開鏈狀態(tài)。重組酶/引物復(fù)合體開始對(duì)雙鏈進(jìn)行掃描，當(dāng)引物在模板上搜索到與之完全匹配的互補(bǔ)序列時(shí)，重組酶/引物復(fù)合體解體，DNA聚合酶結(jié)合到引物的3'端，開始合成新鏈。合成的新鏈又可以作為模板，最終擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，完成靶標(biāo)基因的擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，當(dāng)探針被核酸內(nèi)切酶酶切后，與生物素標(biāo)記的引物共同擴(kuò)增形成兩端有熒光標(biāo)記及生物素標(biāo)記的片段，可用電泳法、熒光法或通用型核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行判讀。如下圖所示：

本試劑盒具有快速、靈敏度高以及特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)組分已混合并冷凍干燥成核酸擴(kuò)增試劑，操作簡(jiǎn)便，易于保存。

引物設(shè)計(jì)

RAA核酸擴(kuò)增技術(shù)對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求與常規(guī)PCR引物設(shè)計(jì)有一定的區(qū)別。由兩條寡核苷酸組成一對(duì)引物，分別特異性識(shí)別一個(gè)核酸目標(biāo)物的上下游核苷酸序列；引物長(zhǎng)度在28-35 nt之間，序列中無(wú)回文序列、連續(xù)單堿基重復(fù)序列和內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)；引物Tm值不作為設(shè)計(jì)時(shí)主要考慮因素。建議在開展RAA（基礎(chǔ)型）擴(kuò)增反應(yīng)之前，先進(jìn)行引物的篩選試驗(yàn)，以便得到較高的檢測(cè)靈敏度。

探針設(shè)計(jì)建議方法：探針長(zhǎng)度在46-52 nt之間，序列避免回文序列、內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復(fù)堿基；探針的5'端用一種抗原標(biāo)記物標(biāo)記，通常為FAM基團(tuán)或羧基熒光素；內(nèi)部含有堿基核苷酸類似物替換核苷酸（例如四氫呋喃殘基THF-有時(shí)稱為'dSpacer'）；3'末端有聚合酶延伸阻斷基團(tuán)（例如C3-spacer，磷酸基或雙脫氧核苷酸）。如下圖所示：

注意：在開始實(shí)驗(yàn)前檢查探針5'端標(biāo)記的基團(tuán)與下游引物5'端標(biāo)記的基團(tuán)是否與所用的試紙條相匹配；建議在開展 RAA試紙條型擴(kuò)增反應(yīng)之前，先進(jìn)行引物的篩選試驗(yàn)，以便得到較高的檢測(cè)靈敏度。

產(chǎn)品說(shuō)明

1. 本產(chǎn)品是“Ready to Use”即用型 RAA/RT-RAA 凍干顆粒；含有除引物和探針外所有的反應(yīng)要素，如重組酶、DNA 聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTP、ATP和PEG 35000等。

2. 試劑盒最低檢測(cè)下限為 10-100copies/測(cè)試（依據(jù)引物篩選優(yōu)化程度和檢測(cè)手段）。

3. RAA試劑，僅擴(kuò)增DNA，RT-RAA能同時(shí)擴(kuò)增DNA和RAA。

4. 基礎(chǔ)型試劑，適用于電泳法分析條帶。

5. 熒光型試劑：含有外切酶（EXO）可使用探針法，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測(cè)。

6. 試紙條型試劑：含有外切酶適用于熒光法和試紙條法分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

適用儀器

恒溫金屬浴、恒溫水浴鍋、熒光PCR儀。

檢測(cè)步驟

1. 核酸樣本提�。赫�(qǐng)參考傳統(tǒng)RNA/DNA 提取方法或其他同效商品化試劑盒提取DNA/RNA樣本。

2. 樣本檢測(cè)
2.1 反應(yīng)體系： 單管反應(yīng)體系（25μL）：

2.2 操作步驟

2.2.1 根據(jù)反應(yīng)數(shù)量，按照反應(yīng)體系配制含有水、上游引物(10 μM)、下游引物(10 μM)的 Mix，混合均勻后加入裝有核酸擴(kuò)增試劑的檢測(cè)單元管中；

2.2.2 向檢測(cè)單元管中加入經(jīng)步驟1處理得到的待測(cè)RNA樣本；

2.2.3 再向檢測(cè)單元管蓋上加入1.5~2.5 μL 的Mg2+，蓋上管蓋，上下顛倒 輕甩充分混勻5-6次，低速離心10 sec； （注：本步驟“是否充分混勻”將決定實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性）

2.2.4 將檢測(cè)單元管放入37~40℃ 恒溫金屬�。ɑ蚝銣厮�浴鍋）中，孵育30min。熒光法則每隔30秒，采集一次熒光信號(hào)。

2.2.5 試紙條檢測(cè)：反應(yīng)結(jié)束后，將25μL反應(yīng)體系液用無(wú)菌水或者PBS稀釋（25μL反應(yīng)體系液:150μL稀釋劑），利用通用型核酸檢測(cè)試紙條進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果分析與判定

可以根據(jù)瓊脂糖電泳、試紙條或熒光法判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果。