下周四下午三點(diǎn)，陳老濕將在線與大家分享Octet及GlyM糖基化試劑盒在抗體樣品的高通量糖型篩選中的應(yīng)用，掃描上圖右下角二維碼即可報(bào)名參與。

究竟如何在細(xì)胞株構(gòu)建階段就實(shí)現(xiàn)高通量的糖型篩選呢？今天我們就先來(lái)一睹為快吧！
 

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單克隆抗體的糖基化位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)[1]

單克隆抗體糖基化修飾多數(shù)為 N-連接的聚糖。IgG抗體一般在Fc段的Asn297有一個(gè)保守的N糖基化位點(diǎn)。其核心結(jié)構(gòu)是由 3 個(gè)甘露糖（Man）和2 個(gè) N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）分子組成的復(fù)雜“雙觸角型”五糖分子的結(jié)構(gòu)，并且不同的糖型可含有不同數(shù)量的其他分子，如巖藻糖（Fuc）、甘露糖、N-乙酰葡糖胺、半乳糖（Gal）、二等分 N-乙酰葡糖胺和唾液酸（Sia）。這些糖鏈的長(zhǎng)度、分叉的方式、單糖的排列順序的差異造成了N-聚糖復(fù)雜多變的結(jié)構(gòu)。
 

單克隆抗體常見(jiàn)糖型
 

糖型種類及豐度都可能影響蛋白藥物的有效性、安全性和質(zhì)量穩(wěn)定性。比如唾液酸含量越高，IgG與Fc受體的親和力越低，從而導(dǎo)致ADCC（抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用）活性降低。融合蛋白中唾液酸含量越高，體內(nèi)清除速率越慢。高甘露糖型的單抗分子與 C1q 的親和力較低，其 CDC（補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性作用） 活性也較低。高甘露糖型結(jié)構(gòu)在人體中容易引起免疫原性。因此糖基化被普遍認(rèn)為是單抗藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA）之一。
 

 

上游工藝中的糖型化檢測(cè)試劑盒
生產(chǎn)工藝中的細(xì)胞株、培養(yǎng)基、培養(yǎng)工藝都可能影響單抗產(chǎn)品的糖基化修飾水平。目前蛋白糖型的鑒定主要是LS-MS（液相質(zhì)譜）的方法，但是這個(gè)方法不適合粗樣品測(cè)試（比如細(xì)胞培養(yǎng)上清），通量也很低。為了解決這個(gè)痛點(diǎn)，賽多利斯專門(mén)開(kāi)發(fā)了基于Octet^®互作儀的糖基化檢測(cè)試劑盒，可以在早期階段，比如CLD（細(xì)胞株篩選）的時(shí)候?qū)μ切退�平進(jìn)行高通量檢測(cè)。
 

 

分別用Octet的傳感器檢測(cè)蛋白濃度（比如用Octet^®蛋白A（ProA）生物傳感器檢測(cè)IgG titer），根據(jù)濃度把所有樣品都調(diào)整在某個(gè)濃度下，然后用糖型化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)糖基化水平，并與濃度信息一起分析來(lái)選取最佳克隆。

目前，賽多利斯已推出唾液酸（GlyS）檢測(cè)試劑盒和甘露糖（GlyM）檢測(cè)試劑盒，原理是將能特異性識(shí)別某種糖型的凝集素固化在傳感器上，然后與糖基化樣品結(jié)合，再通過(guò)信號(hào)放大的方法對(duì)糖基化水平進(jìn)行排序。

下面分別是兩種試劑盒能夠識(shí)別的糖型：
 

甘露糖（GlyM）檢測(cè)試劑盒：可以識(shí)別高甘露糖型，雜合型和雙觸角復(fù)合型N聚糖
 

唾液酸（GlyS）檢測(cè)試劑盒：主要識(shí)別末端為唾液酸的糖基

試劑盒使用方法
對(duì)于純樣品來(lái)說(shuō)，可以使用“一步法”，即固化了凝集素的傳感器直接與糖基化蛋白反應(yīng)，通過(guò)蛋白結(jié)合速率來(lái)進(jìn)行排序。而粗樣品或者糖基化水平比較低的純樣品一般需要通過(guò)酶底物信號(hào)放大。
 
“一步法”對(duì)純樣品進(jìn)行糖基化檢測(cè)
 

多步法”信號(hào)放大，用GlyM傳感器與糖基化樣品孵育，然后用二抗和酶底物進(jìn)行信號(hào)放大。

樣品孵育可以離線進(jìn)行，賽多利斯提供Octet® AS離線孵育裝置。
 
左圖是GlyM試劑盒檢測(cè)信號(hào)放大的原始圖，右圖是信號(hào)與甘露糖百分比的相關(guān)性。GlyM檢測(cè)信號(hào)與甘露糖百分比相關(guān)性高。

方法的優(yōu)勢(shì)

1. 通量高，測(cè)試速度比較快，如果用8通道的儀器檢測(cè)96個(gè)樣品，只需要2個(gè)小時(shí)，而16通道和96通道則分別只需要70分鐘和半個(gè)小時(shí)；
2. 可以直接在粗樣品中對(duì)糖基化水平進(jìn)行排序，目前市面上還沒(méi)有類似產(chǎn)品；
3. 全自動(dòng)化檢測(cè)，重復(fù)性好；

• 對(duì)了，其他糖型試劑盒也正在路上...