分離的人類(lèi)胰島的三維重建:綠色的胰島素(AF488)，紅色的胰高血糖素(AF555)，洋紅色的IL-17 (AF647)和藍(lán)色的細(xì)胞核（Hoechst）Courtesy Prof. Von Herrath, San Diego, CA (USA)
 
細(xì)胞是生命的基本單位，細(xì)胞生物學(xué)是研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的學(xué)科。細(xì)胞生物學(xué)研究熱點(diǎn)主要聚焦在細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、細(xì)胞信號(hào)通路、細(xì)胞器功能和結(jié)構(gòu)解析、能量代謝和表觀遺傳等方面，細(xì)胞生物學(xué)研究難點(diǎn)在于細(xì)胞是非常精密且微小的單位，而觀察設(shè)備存在空間、時(shí)間以及分辨率上的限制。
 
隨著顯微鏡和染色技術(shù)的改進(jìn)，科學(xué)家們能夠看到越來(lái)越多的細(xì)胞內(nèi)部細(xì)節(jié)。范·列文虎克使用的顯微鏡可能把標(biāo)本放大了幾百倍。今天，高分辨率熒光顯微鏡可以在微米及以下范圍觀察細(xì)胞器的形狀，借助活細(xì)胞工作站可以將細(xì)胞的生命活動(dòng)完整記錄下來(lái)；通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行三維光學(xué)切片成像，使研究人員能夠生成細(xì)胞的詳細(xì)三維圖像；利用STED納米顯微鏡可以探究細(xì)胞器內(nèi)部結(jié)構(gòu)、離子通道的亞基甚至分子水平的精細(xì)結(jié)構(gòu)信息……想要充分?jǐn)U展自己的研究成果并獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，選擇合適的顯微成像方法至關(guān)重要。
  
細(xì)胞生物學(xué)研究痛點(diǎn)

研究目標(biāo)	特點(diǎn)	成像痛點(diǎn)
細(xì)胞器（線(xiàn)粒體、中心體等） 細(xì)胞骨架（微絲微管等） 其他微小結(jié)構(gòu)（細(xì)菌、真菌） 細(xì)胞膜 細(xì)胞核內(nèi)微小結(jié)構(gòu)	結(jié)構(gòu)非常小，常規(guī)分辨率無(wú)法實(shí)現(xiàn)精細(xì)觀察	受衍射限制傳統(tǒng)成像分辨率不夠，成像結(jié)果結(jié)構(gòu)不清晰； 定位不精確
活細(xì)胞快速成像	活細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定成像； 結(jié)構(gòu)小，運(yùn)動(dòng)的細(xì)胞，信號(hào)較弱	活細(xì)胞成像速度、分辨率和穩(wěn)定性不夠； 弱信號(hào)采集不到； 寬場(chǎng)分辨率不夠
活體動(dòng)物（斑馬魚(yú)、小鼠、大鼠） 器官、類(lèi)器官等	在體細(xì)胞水平研究，需要多色深度成像； 功能成像（代謝、微環(huán)境等）	多色成像不靈活，操作復(fù)雜； 傳統(tǒng)FLIM速度慢，費(fèi)時(shí)
細(xì)胞操作 光操作，細(xì)胞消融 細(xì)胞分離切割精準(zhǔn)取材 細(xì)胞到電鏡聯(lián)用	精準(zhǔn)的細(xì)胞操作，漂白，消融快速成像； 分離單細(xì)胞或染色體 電鏡觀察的局限	速度慢，無(wú)法漂白，不能做細(xì)胞切割； 光鏡到電鏡有路線(xiàn)障礙

 
 

• STED納米顯微成像技術(shù)

• DMi8 Infinity TIRF

TIRF（全內(nèi)反射熒光顯微鏡）主要應(yīng)用方向：細(xì)胞膜成像、囊泡運(yùn)輸、單分子示蹤、受體動(dòng)力學(xué)變化/聚集、受體超分辨成像、體外蛋白研究、細(xì)胞骨架組裝、胞吞胞吐、細(xì)胞粘附、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。   

• STELLARIS FALCON快速熒光壽命成像系統(tǒng)

STELLARIS FALCON是Leica最新的集成整合方案，將FLIM完美結(jié)合到STELLARIS共聚焦平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)快速FLIM數(shù)據(jù)采集。
 
目前，F(xiàn)LIM技術(shù)越來(lái)越多的應(yīng)用到生物學(xué)研究中，常見(jiàn)的應(yīng)用有測(cè)定分子相互作用FLIM-FRET，環(huán)境感知和組分分離等，在活細(xì)胞中典型應(yīng)用就是利用FLIM-FRET研究活細(xì)胞分子相互作用。
  排除熒光漂白和淬滅對(duì)FRET測(cè)定的影響，精準(zhǔn)測(cè)量分子間相互作用強(qiáng)度。無(wú)需考慮acceptor熒光，實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單�？蛇M(jìn)行離體活細(xì)胞和在體活細(xì)胞快速FLIM-FRET測(cè)量。
  Fast FLIM image and FLIM phasor plot of U2OS cells labeled with Flipper TR, left cell in cell culture medium, right cell treated with 5% concentration glucose
 
  細(xì)胞是組成生命個(gè)體的基本單位，實(shí)時(shí)在線(xiàn)研究細(xì)胞的增殖、代謝、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)，有助于了解細(xì)胞的生命規(guī)律，通過(guò)現(xiàn)象揭示生命本質(zhì)。
 

THUNDER高分辨活細(xì)胞解決方案

C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移到雙方transwell膜沾核纖層蛋白B(紅色)核結(jié)構(gòu),赫斯特(藍(lán)色)的DNA,和γpAX DNA損傷(黃色)。細(xì)胞成像使用THUNDER活細(xì)胞培養(yǎng)成像系統(tǒng)與63X/1.4油浸物鏡。圖片上面代表擴(kuò)展景深預(yù)測(cè)厚17.47µm z-stacks。
圖片由美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校生物科學(xué)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)、生理學(xué)和行為系盧卡斯·史密斯博士提供。
 

STELLARIS Lightning

細(xì)胞生物學(xué)研究已經(jīng)不再局限于細(xì)胞層面觀察，而是聚焦于亞細(xì)胞器、染色體、離子通道等細(xì)小結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)寬場(chǎng)熒光顯微鏡雖然有成像速度快、光毒性低的有點(diǎn)，但是空間分辨率并不能滿(mǎn)足對(duì)亞細(xì)胞器更精細(xì)結(jié)構(gòu)解析的分辨率需求。Leica STELLARIS Lightning超分辨系統(tǒng)基于共聚焦平臺(tái)，XY分辨率達(dá)到120nm，Z方向達(dá)到了200nm，超越了普通共聚焦光學(xué)極限。
  STELLARIS的每個(gè)檢測(cè)器都是光譜式檢測(cè)器，可以實(shí)現(xiàn)410nm-850nm光譜檢測(cè)，配備獨(dú)家的485-685nm或440-790nm白激光，譜線(xiàn)任意可調(diào)，滿(mǎn)足染料最佳激發(fā)譜線(xiàn)需求。白激光和HyD檢測(cè)器實(shí)現(xiàn)激發(fā)和發(fā)射光譜檢測(cè)自由。STELLARIS共聚焦平臺(tái)使用棱鏡分光和狹縫檢測(cè)，在任意波長(zhǎng)都可以有非常高的分光效率，做到最大程度利用熒光信號(hào)。
    
NE-115細(xì)胞同時(shí)標(biāo)記了actin-mNeonGreen、Mitotracker Green、細(xì)胞核Red和SiR-tubulin共4種熒光染料，但由于LifeAct-mNeonGreen和Mitotracker Green的發(fā)射光譜高度重疊，NuC Red和SiR-tubulin的發(fā)射光譜高度重疊，所以在用常規(guī)共聚焦（左圖）拍攝時(shí)只能體現(xiàn)出兩種信號(hào)的差異。而在TauSeparation模式下（右圖），基于平均光子到達(dá)時(shí)間AAT，我們使用一個(gè)檢測(cè)器就可以同時(shí)將這兩種發(fā)射光譜重疊的染料區(qū)分出來(lái)（LifeAct-mNeonGreen-紅色，Mitotracker Green-綠色，Nuc Red–青色，SiR-tubulin–品紅色），所以只需要使用兩個(gè)檢測(cè)器，就可以得到這幅沒(méi)有串色的4色熒光圖像了。
  
 

STELLARIS DIVE光譜式多光子顯微成像系統(tǒng)

 

多光子FLIM在活體細(xì)胞水平研究藥物靶向作用機(jī)理 

用FLIM-FRET研究藥物對(duì)胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)的靶向作用，實(shí)現(xiàn)了對(duì)腫瘤不同微區(qū)的單細(xì)胞反應(yīng)的觀察。
   

STELLARIS DLS光片成像

Leica STELLARIS共聚焦平臺(tái)可以無(wú)縫升級(jí)light sheet功能，升級(jí)后一套儀器同時(shí)擁有完整的共聚焦和光片的功能。Leica DLS數(shù)字光片技術(shù)可快速實(shí)現(xiàn)雙側(cè)照明，具有光毒性低，成像速度快，適合3D成像的優(yōu)點(diǎn)。DLS和雙光子共聚焦搭配，可以實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)損傷和快速光片成像相結(jié)合。   
 

• Leica DMi8 Infinity Scanner

Leica Infinity Scanner實(shí)現(xiàn)快速：

• 激光切割、消融、解籠鎖、DNA損傷
• 光激活、光開(kāi)關(guān)、漂白、光遺傳
• FRET受體漂白法等光學(xué)刺激實(shí)驗(yàn)

   

• Leica DMi8 Infinity PLU脈沖激光模塊

Infinity PLU應(yīng)用： 活細(xì)胞切割 活細(xì)胞和細(xì)胞器消融 DNA損傷

 
 
   

• 激光顯微切割精準(zhǔn)取材

Leica激光顯微切割優(yōu)勢(shì) 1.正置鏡平臺(tái)，適合病理切片和活細(xì)胞樣本切割； 2.明場(chǎng)和熒光實(shí)時(shí)切割，操作簡(jiǎn)單快速； 3.紫外激光切割，直接汽化，切緣平整不損傷生物大分子； 4.專(zhuān)利的激光束移動(dòng)切割，切割精度可達(dá)0.07μm； 5.重力收集，簡(jiǎn)單高效，收集耗材成本低，實(shí)用高通量切割工具

    
傳統(tǒng)光電聯(lián)用受限于光鏡分辨率，熒光數(shù)據(jù)在電鏡下目標(biāo)不明確，THUNDER Cryo-CLEM是冷凍光電聯(lián)用專(zhuān)用設(shè)備，具有分辨率高可以精準(zhǔn)識(shí)別細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在相關(guān)工作流程中平穩(wěn)、安全傳送坐標(biāo)、圖像和樣本。
    
徠卡冷凍光電聯(lián)用優(yōu)勢(shì)：
    冷凍光鏡專(zhuān)用傳輸桿，更換樣品方便
    傳輸桿液氮控溫，確保樣品安全轉(zhuǎn)移
    有普通載網(wǎng)夾具和Auto grid夾具
    該流程中所有附件均由徠卡提供，避免第三方紛爭(zhēng)