默克公司PPDM ADME Biologics部門(mén)利用全自動(dòng)Western blot系統(tǒng)Wes，研究納米抗體早期ADA免疫原性評(píng)估，文章發(fā)表在Journal of Pharmacological and Toxicological Methods：A capillary electrophoresis based approach for the identification of anti-drug antibodies against camelid VHH biologics (Nanobodies®), J Pharmacol Toxicol Methods. May-Jun 2020;103:106872.
 

--研究背景--

納米抗體（Nanobody）：除了由包含兩個(gè)重鏈和兩個(gè)輕鏈的四個(gè)亞基組成的正常異四聚體抗體以外，駱駝科動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生獨(dú)特的僅重鏈的抗原結(jié)合蛋白，其單個(gè)可變域（VHH）大小約為15kDa。納米抗體是分離的VHH結(jié)構(gòu)域，可以與短肽序列連接在一起，形成具有多對(duì)位或多特異性結(jié)合特性的多價(jià)模塊化構(gòu)建體。因此，納米抗體被評(píng)估為潛在的生物治療方法。
 

抗藥物抗體（Anti-drug-antibody，ADA）：蛋白質(zhì)類(lèi)藥物的特異性，以及可調(diào)節(jié)的定位和靶向特性極大的改變了原有的藥物臨床使用領(lǐng)域。但基于蛋白質(zhì)本身獨(dú)特的復(fù)雜性，其藥物制劑勢(shì)必會(huì)具有引起抗藥物抗體應(yīng)答（ADAs）的潛力。而ADA的產(chǎn)生，對(duì)藥物暴露、藥物毒性作用、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)造成影響，甚至導(dǎo)致不良的安全后果。因此，對(duì)于ADA免疫原性評(píng)估在確定生物候選藥物的最終臨床成功方面非常重要。

因此，默克公司利用ProteinSimple公司的全自動(dòng)Western Blot系統(tǒng)Wes（可以高靈敏度和高精度地定量靶蛋白的水平），開(kāi)發(fā)了一種WESADA平臺(tái)，用于評(píng)價(jià)納米抗體（Nb）藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中ADA的評(píng)估。

ProteinSimple公司Wes工作原理：

--研究?jī)?nèi)容--

納米抗體X、Y、Z構(gòu)型

納米抗體X：由5個(gè)VHH組成：A，B，C，D和E。

納米抗體Y：由2個(gè)NHH組成：B和E。

納米抗體Z：由3個(gè)NHH組成：A，C和E。

A和B：兩種不同的抗鼠淋巴細(xì)胞激活基因3（LAG3）的VHH。

C和D：兩種不同的抗鼠編程性細(xì)胞死亡蛋白1（PD1）的VHH。

E：結(jié)合白蛋白的VHH，用于延長(zhǎng)半衰期。

相同的35個(gè)氨基酸的GS-接頭連接所有VHH。 

納米抗體X滴度測(cè)定

為了確定固定在毛細(xì)管中的有效納米抗體濃度，以納米抗體X作為樣本，進(jìn)行2倍稀釋（從80降至1.25μg/mL）進(jìn)行上樣，以兩個(gè)ADA陽(yáng)性樣品和抗納米抗體mAb1作為一抗，進(jìn)行檢測(cè)。最終選擇20μg/mL作為所有毛細(xì)管固定的納米抗體的默認(rèn)濃度。

WESADA更寬的動(dòng)態(tài)信號(hào)范圍
 

將WESADA動(dòng)態(tài)范圍與其他兩個(gè)常用的ADA分析平臺(tái)進(jìn)行了比較：1）MSD平臺(tái)2）Gyros。為了在所有三個(gè)平臺(tái)上進(jìn)行比較，要求最小的信噪比等于或高于10。如圖所示（▲：WESADA），WESADA平臺(tái)展示了更寬的動(dòng)態(tài)范圍。

ADA信號(hào)滴定

WESADA信號(hào)用兩種ADA陽(yáng)性樣品E和8的不同濃度進(jìn)行滴定。當(dāng)納米抗體濃度固定時(shí)，ADA陽(yáng)性樣品E在5120倍稀釋因子時(shí)有信號(hào)，而樣品8在1280倍稀釋因子才有信號(hào)。表明小鼠樣品E的ADA滴度比樣品8高。

WESADA信號(hào)的特異性

為了確認(rèn)WESADA信號(hào)的特異性，將ADA陽(yáng)性的小鼠樣品與500μg/mL天然納米抗體預(yù)孵育，再與納米抗體X反應(yīng)。結(jié)果顯示，所有ADA陽(yáng)性小鼠血清樣品和陽(yáng)性對(duì)照抗納米抗體mAb1的AUC均降低61％至100％。證明了ADA對(duì)天然納米抗體X的特異性。

WESADA同時(shí)對(duì)每個(gè)毛細(xì)管的多個(gè)目標(biāo)進(jìn)行ADA分析

為了測(cè)試WESADA同時(shí)進(jìn)行ADA分析的可行性，將NanobodyX（5個(gè)VHH模塊）單獨(dú)上樣，或者與NanobodyY（3個(gè)VHH模塊）共同上樣，跑膠后固化在毛細(xì)管上。再運(yùn)行5種小鼠ADA陽(yáng)性血清樣品作為一抗進(jìn)行檢測(cè)。如圖所示，WESADA可用于同一毛細(xì)管中固定多個(gè)納米抗體來(lái)檢測(cè)ADA。

多聚納米抗體的ADA特異性分析

利用WESADA檢測(cè)來(lái)確定哪些VHH模塊負(fù)責(zé)檢測(cè)到的ADA信號(hào)。給予納米抗體X（模塊A，B，C，D，E）的小鼠表現(xiàn)出很強(qiáng)的ADA反應(yīng)，而給予納米抗體Z（模塊A，C，E）的小鼠表現(xiàn)出相對(duì)較低的信號(hào)反應(yīng)。這表明模塊B或D可能是針對(duì)納米抗體X觀察到的ADA信號(hào)的原因。為了測(cè)試這種可能性，選擇5種針對(duì)納米抗體X的ADA信號(hào)最強(qiáng)的血清樣品（小鼠1，2，4，5，8，在圖中標(biāo)有*），對(duì)5種模塊進(jìn)行單獨(dú)檢測(cè)。結(jié)果顯示，五分之四樣品顯示模塊B的反應(yīng)較高，而對(duì)模塊A，C，D，E的信號(hào)則低至無(wú)法檢測(cè)到。這表明模塊B主要負(fù)責(zé)針對(duì)納米抗體X的ADA響應(yīng)。

結(jié)論：

蛋白類(lèi)藥物的不良免疫反應(yīng)可能會(huì)對(duì)藥物的藥代動(dòng)力學(xué)，功效和安全性產(chǎn)生不利影響。而抗藥物抗體（ADA）的存在已成為免疫原性應(yīng)答的關(guān)鍵決定因素。本文利用ProteinSimple的Wes系統(tǒng)建立了WESADA平臺(tái)�？梢詫�(duì)ADA的陽(yáng)性樣品進(jìn)行鑒定，同時(shí)可以確定多價(jià)納米抗體構(gòu)建物中的哪個(gè)VHH模塊刺激了主要的ADA反應(yīng)。同時(shí)還允許對(duì)同一實(shí)驗(yàn)樣品中具有不同分子大小的多個(gè)目標(biāo)同時(shí)進(jìn)行ADA分析。這種基于毛細(xì)管電泳的方法可對(duì)樣品進(jìn)行快速分析，而無(wú)需單獨(dú)定制優(yōu)化或試劑標(biāo)記，同時(shí)只需消耗少量樣品和藥物。因WESADA檢測(cè)到的任何ADA信號(hào)都可以與毛細(xì)管中藥物的預(yù)期分子量大小相關(guān)，從而排除了非特異性結(jié)合，提供了信號(hào)對(duì)藥物具有特異性的額外置信度。預(yù)示著WESADA平臺(tái)有助于在蛋白類(lèi)藥物早期開(kāi)發(fā)階段對(duì)大量實(shí)驗(yàn)性候選藥物進(jìn)行便捷的免疫原性評(píng)估。